谷子分蘖相关QTL定位及紧密连锁标记开发

杜晓芬，王 军，李云飞，王智兰，袁国保，杜国华，韩 芳，彭建祥，张文娜，蔡 伟，袁 峰，崔巨多，郭二虎，邹洪锋，张林义，彭书忠

(1.山西省农业科学院 谷子研究所，山西省特色杂粮种质资源发掘与育种重点实验室，山西 长治 046011；2.华大农业应用研究院，广东 深圳 518083；3.华大小米产业股份有限公司，广东 深圳 518083；4.延安市农业科学研究所，陕西 延安 716000)

对于许多主要农作物(如小麦、水稻、大麦和高粱等)来说，分蘖是与产量直接相关的重要农艺性状之一[1]。一方面，分蘖会影响整个植株的株型，导致植株的光吸收能力、开花和结实率发生变化，最终使产量发生改变[2]；另一方面，分蘖可以产生不定根，这使得分蘖株能够在没有主茎的情况下正常生长，从而维持一定的群体产量[1,3]。

分蘖是由主茎基部的节发生的分枝，其形成是许多因子相互作用的结果，这些因子包括环境信号、激素途径和基因调控网络[4-5]。前人已经对一些主要禾谷类作物的分蘖遗传机制进行了广泛研究。水稻的研究结果表明，光、温、水、肥等环境因素[6-7]，生长素、细胞分裂素、独脚金内酯[8]等激素都会影响水稻分蘖的形成和生长发育。同时，水稻中相继克隆了11个控制分蘖的基因，包括水稻分蘖过程中的关键调控基因MOC1[9]，其余几个为多蘖矮秆基因(D3、D17、D10等)[10-18]，这些基因与激素共同调控分蘖形成的相关网络也得到解析[19-20]。除此之外，分蘖通常还受数量性状位点(QTL)控制。根据Gramene网站(http://archive.gramene.org/qtl)统计结果，目前水稻在不同群体中已经鉴定分蘖相关QTL共计213个，高粱中共计19个。小麦中也有一些控制分蘖主效位点的研究报道[21-23]。近年来，谷子中分蘖相关QTL的定位研究也有相继报道。Doust等[24-25]利用F2∶3群体分别在不同温度和不同密度种植条件下共鉴定了41个谷子分蘖相关QTL；Jia等[26]利用全基因组关联方法鉴定了5个环境条件下共计57个与分蘖相关的位点；Mauro-Herrera等[3]利用重组自交系群体分别在温室和大田条件下，检测到谷子苗期、开花期和成熟期共42个控制分蘖相关QTL；Zhang等[27]利用重组自交系群体分别在长日照和短日照条件下共检测到6个控制分蘖相关QTL。尽管如此，有关环境因素和激素因子如何影响谷子分蘖的形成和生长发育，其机制还不清楚。

与其他主要农作物相比，谷子农艺性状基因或QTL发掘研究还比较落后。随着谷子参考基因组的公布[28-29]，谷子中许多遗传研究相继开展，尤其是多种类型的分子标记被开发并应用于基因精细定位、基因克隆和分子标记辅助选择。Sato等[30]和Masumoto等[31]利用SSR(Simple sequence repeat)和TD(Transposon display)标记完成了谷子stb1和NEKODE1基因的精细定位；利用SNP(Single nucleotide polymorphism)、CAPS(Cleaved-amplified polymorphic sequence)和InDel(Insertion-deletion)等不同分子标记，谷子SiDWARF2、SiDWARF3、SiYGL1、SiAGO1b和Loosepanicle1等基因相继精细定位和克隆[26, 32-37]。随着下一代测序技术的发展，涌现出了不少新的快速对目标基因或QTL进行定位的方法，其中包括简化基因组测序技术-RAD-seq，该技术利用限制性内切酶对基因组进行酶切，产生一定大小的片段，构建测序文库，对酶切后产生的RAD标记进行高通量测序，具有通量高、准确性高、性价比高、试验周期短和不受基因组序列限制等优点[38]，已经广泛应用于SNP标记开发、高密度遗传图谱构建、植物重要性状的QTL定位等研究领域。谷子中也有利用RAD-seq技术对株高、米色等重要农艺性状进行QTL定位的研究报道[39-40]。

本研究采用简化基因组测序技术(RAD-seq)，以2个谷子分蘖型农家种(母本)和2个不分蘖育成种(父本)，为亲本杂交获得F1，F1各自自交后获得的2个F2群体为主要研究对象， 对谷子分蘖相关QTL进行了分析；同时，新开发了与分蘖QTL(qAJTN7-3和qHCTN7)紧密连锁的分子标记，旨在为谷子分蘖基因的克隆和解析分蘖遗传机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究分别以2个F2分离群体为主要研究对象，其中，矮宁黄×晋谷21号杂交组合，以分蘖农家种矮宁黄为母本、不分蘖育成种晋谷21号为父本，命名为Cross AJ；红苗粘谷×长农35号杂交组合，以分蘖农家种红苗粘谷为母本、不分蘖育成种长农35号为父本，命名为Cross HC(图1)。于2014年获得2个杂交组合的F1单株，2015年将收获的F1单株及其亲本种植于山西省农业科学院谷子研究所试验田，通过2个杂交组合F1单株分别自交，获得了2个不同的F2遗传群体(Cross AJ、Cross HC)。为便于调查，亲本及群体均采用宽窄行种植模式，宽行行距0.48 m，窄行行距0.18 m，行长3 m。于谷子分蘖期调查分蘖数(含主茎)，亲本取5株调查，取其平均数作为分蘖数值，F2群体逐株挂牌调查。另外，在本研究中，用于验证InDel标记和分蘖数间相关性的160份谷子种质(部分种质由中国农业科学院国家农作物种质资源库提供)的种植模式、调查方式与F2群体及其亲本相同。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA样品准备和提取 DNA取样：待幼苗长至三叶一心时，剪取适量叶片放入2 mL离心管内，然后迅速放入-80 ℃超低温冰箱保存备用。谷子基因组DNA提取采用CTAB法[41]。

1.2.2 连锁图谱构建和QTL分析 RAD-seq试验方法及步骤参照Baird等[42]描述进行，参考基因组版本Setaria_italica_v2.0(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=foxtail+millet)，选取限制性内切酶EcoRⅠ(Cross AJ)和TaqⅠ(Cross HC)分别酶切基因组DNA用于构建RAD-seq DNA文库，使用Illumina HiSeq X Ten平台进行测序。根据识别标签序列得到每个个体的测序reads，使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)[43]软件将个体reads与参考基因组进行序列比对。比对结果进行格式转换后使用GATK(Genome Analysis ToolKit)[44]软件和SAMtools[45]软件用于检测SNP和过滤SNP，SNP鉴定和基因分型方法参照Wang等[39]描述。使用MSTmap[46]软件用于分子标记排序(主要参数：作图函数为Haldane、P值为0.000 000 1、缺失阈值为0.3、目标函数为最大似然法)和连锁图谱构建(取最小阈值LOD 5.0对所有标记进行分组，每个连锁群上标记顺序通过两两标记之间的最小重组频率计算)。

利用WinQTLCart 2.5[47]软件中复合区间作图法(CIM)进行分蘖数QTL定位。进行CIM分析时，选用步长(Walking speed)1 cM和滑窗(Scanning window)10 cM，按照模型6，选取1 000次排列测验，显著水平设置为0.05，判断是否存在QTL。QTL的命名方法为：q加群体简称(AJ、HC)，后面加性状简写(TN)，最后加染色体名称(当同一条染色有多个QTL时加-1，-2)。

1.2.3 分子标记开发 本研究利用GATK[44]软件搜索InDel，InDel长度设定在1～10 bp。根据选定InDel位点的侧翼序列(上游250 bp，下游250 bp)设计引物进行验证，引物设计采用Primer 3.0(http://primer3.ut.ee/)在线设计，引物由天一辉远(北京)有限公司合成，本研究用到引物序列为MRI5F：5′-GTAGTCGTCCGTCCAAGC-3′，MRI5R：5′-CACCAC CATCAAACAAAGG-3′；MRI322F：5′-GGCAATCCCAA GTATGTGCA-3′，MRI322R：5′-AAGGGAGGAAGTGAA GGTGG-3′；MRI348F：5′-TCTGGTCACCTGTCGTTCTC-3′，MRI348R：5′-AAGTAAGCCACCGTAGCCTT-3′；MRI351F：5′-AAGTTGCCCTTAACCCACCT-3′，MRI351R：5′-GACATTGCCTCGCCGTAAAA-3′；MRI381F：5′-AACC TCCACCATGAAACCCT-3′，MRI381R：5′-CTGGGAGG AAAGAGGGAGTG-3′。

PCR反应体系为10 μL，包括：1 μL 10×PCR Buffer，1 μL 双向引物(2 μmol/L)，0.8 μL dNTP(2.5 mmol/L)，0.1 μLTaqDNA聚合酶，1 μL 模板DNA(50 ng/μL)，灭菌水 6.1 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；最后72 ℃终延伸5 min。

PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，根据Marklund等[48]描述方法银染显色，拍照后统计存档。

1.3 数据分析

亲本和F2群体的表型分析、分子标记分型与160份谷子种质(包括112不分蘖种质和48份分蘖种质)表型相关性分析采用统计分析软件SPSS 17.0。

2 结果与分析

2.1 表型分析

矮宁黄×晋谷21号群体(Cross AJ)共获得543个F2单株，红苗粘谷×长农35号群体(Cross HC)共获得131个F2单株。亲本表型如图1所示，2个F2群体及其亲本分蘖数统计如表1所示。对于Cross AJ，亲本之间有较大差异，其F2群体变异范围为1～9；对于Cross HC，亲本差异较Cross AJ群体的亲本略小，F2群体变异范围为1～4。

表1 两个F2群体及其亲本分蘖数分析Tab.1 Phenotypic data of tiller number in two F2 populations

图1 两个F2群体亲本的表型Fig.1 The phenotype of four parents in two F2 populations

2.2 基于RAD-seq的高密度遗传图谱的构建

本研究利用RAD-seq技术，对Cross AJ的亲本和543个F2单株、Cross HC的亲本和131个F2单株进行测序。结果表明，Cross AJ共获得88.33 Gb的原始数据，对原始数据初步分析后，统计出数据的平均测序深度为4.55×，平均上图率为89.77%；Cross HC共获得872 Mb的原始数据，平均测序深度3.12×，平均上图率89.37%(表2)。

通过SNP鉴定后，筛选亲本间可信度高的SNP多态性标记，然后对群体个体进行基因型检测，最后利用MSTmap软件绘制遗传连锁图谱。Cross AJ共获得48 790个上图SNP标记，总图距为1 461 cM；Cross HC共获得9 968个上图SNP标记，总图距为1 648.8 cM(表2)。

表2 两个F2群体的RAD-seq统计结果Tab.2 Summary of RAD-seq in two F2 populations

2.3 分蘖相关QTL分析

结合2个F2群体的表型数据和SNP标记分型结果，利用WinQTLCart 2.5软件进行分蘖相关QTL定位。本研究共鉴定出8个QTL(表3)。在Cross AJ群体中，共鉴定了6个QTL，分别为qAJTN1、qAJTN5、qAJTN7-1、qAJTN7-2、qAJTN7-3和qAJTN9，解释表型变异0.7%～9.8%；在Cross HC群体中，共鉴定了2个QTL，分别为qHCTN5和qHCTN7，解释表型变异1.4%～8.3%。在这些QTL中，效应较大的有qAJTN5、qAJTN7-3和qHCTN7，分别解释表型变异的9.8%，9.3%和8.3%，其加性效应值分别为0.58，0.45和0.43，说明其增效等位基因来自母本矮宁黄或红苗粘谷。

表3 分蘖相关QTL分析Tab.3 QTL analysis of tillering in two F2 populations of foxtail millet

2.4 分蘖数紧密连锁InDel标记开发

在2个群体中各选择了1个效应较大的QTL(qAJTN7-3和qHCTN7)，并在其定位区间内开发了新的紧密连锁分子标记，以有利于分蘖性状的分子标记辅助选择。首先，将亲本基因组测序结果与豫谷1号参考基因组进行序列比对，搜索插入缺失位点，设计引物进行PCR扩增，扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，筛选在亲本之间具有多态性的标记，进一步获得在F2后代中能够良好分型的InDel标记(图2-A)。其次，利用MSTmap软件对新标记进行遗传连锁分析。连锁分析结果发现，标记MRI351和MRI322定位在qAJTN7-3区间内；MRI351、MRI5、MRI348和MRI381定位在qHCTN7区间内(图2-B)。

A.标记MRI351和MRI381在亲本和2个F2群体部分单株中的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；B、C.标记MRI5、MRI348、MRI322、MRI351和MRI381在各自染色体上的位置。P1.矮宁黄，P2.晋谷21，P3.红苗粘谷，P4.长农35；1-9为Cross AJ的部分F2单株，其中，1-3单株表型为分蘖，4-9表型为不分蘖；10-18为Cross HC的部分F2单株，其中，10-12单株表型为分蘖，13-18表型为不分蘖。

为了进一步确认InDel标记和分蘖数间的相关性，选取了2个F2群体中的标记MRI351和MRI381，对160份谷子种质进行了基因分型和相关性分析(表4)。根据分子标记检测结果，将与分蘖亲本带型一致的基因型标记为“1”，与不分蘖亲本带型一致的基因型标记为“0”，与双亲带型均不一致的基因型标记为“2”，没有扩增结果的标记为“-”。利用统计分析软件SPSS 17.0的Pearson′s双侧检验，得到相关系数R分别为0.280(标记MRI351)和0.242(标记MRI381)，且差异达到极显著水平(表5)。上述结果表明，MRI351和MRI381与分蘖性状紧密连锁，可应用于分蘖型谷子分子标记辅助育种。

表4 160份谷子种质和标记MRI351、MRI381基因分型结果Tab.4 The genotype of MRI351 and MRI381 in the 160 foxtail millet accessions

表4(续)

表4(续)

表5 分蘖数与标记间的相关性分析Tab.5 Correlation analysis between tiller number and markers

注：**表示差异极显著(P<0.01)。

Note：**indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 讨论

本研究基于简化基因组测序技术(RAD-seq)，以2个F2群体(Cross AJ和Cross HC)为主要研究对象，共鉴定了8个控制分蘖数的QTL。其中，qAJTN1、qAJTN5、qAJTN7-2、qAJTN9和qHCTN5等5个QTL为本研究新鉴定的位点，其余3个QTL(qAJTN7-1、qAJTN7-3和qHCTN7)与Jia等[26]和Mauro-Herrera等[3]检测的QTL相一致。

在本研究中，鉴定的较大效应位点qAJTN5(9.8%)的临近区域，Doust等[24]检测到的分蘖相关QTL可解释表型变异率为28.1%，Mauro-Herrera等[3]检测到的分蘖相关QTL(Br5c)可解释表型变异率为23.6%，Zhang等[27]检测到的分蘖相关QTL(qtn5)可解释表型变异率为25.72%和11.31%，这些QTL效应值都比较大，这很可能是由于控制同一性状的QTL成簇分布或群体差异造成的。这些结果也暗示，在谷子第5染色体存在稳定的控制分蘖相关的QTL，相关QTL区间是发掘控制分蘖相关基因的关键区间。

同时，数量性状QTL定位准确性很容易受作图群体和环境因素影响。同一性状QTL在不同群体(F2、F2∶3、RIL和NIL)中效应大小可能不同，相对于F2和F2∶3群体来说，由于RIL和NIL群体能进行多年多点重复试验，其QTL定位结果更加可靠、稳定[3, 24-25, 49]。F2群体的表型数据不能重复，因此，利用F2群体鉴定的QTL效应需要用高级群体进一步验证。尽管如此，目前在农作物中也有一些利用F2群体定位QTL的研究报道[50-52]，尤其是结合下一代测序技术能对目标性状进行快速定位[53-54]。本研究采用下一代测序技术，分别利用F2大群体(543个单株)和小群体(131个单株)对控制分蘖数的QTL进行定位研究，与前人研究相比，有一致位点QTL(qAJTN7-1、qAJTN7-3和qHCTN7)，也有临近位点QTL(qAJTN5)，比较而言，利用大群体检测到了更多与前人研究结果相同或相近的位点，而利用小群体定位的相同或相近位点较少，这表明基于F2大群体的简化基因组测序定位QTL可靠性较F2小群体更强，至于F2大群体与高级群体间的效率差异，还需要进一步利用该F2群体的重组近交系群体进行多年多点试验来验证。

InDel标记具有带型简单、密度高、变异稳定、多态性强、易检测等特点，被广泛应用于作物种质资源品种鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助育种中。赵庆英等[55]利用晋谷21重测序结果开发了一个晋谷21特异的InDel标记2G5501976，该标记可快速鉴定该品种是否为晋谷21或其衍生品种。姜童等[56]利用25对InDel标记对8个鲁西南地区簇生朝天椒品种构建InDel分子遗传图谱，从而对不同品种的相似度进行评价。田希辉等[57]开发了11个与白菜苗期TuMV-C4抗性连锁的InDel标记，这些标记对高抗单株选择的准确率达78%以上，这为白菜TuMV抗性分子育种奠定了良好基础。本研究开发的InDel标记MRI351和MRI381，统计分析表明，与分蘖性状紧密连锁，这为分蘖基因的克隆和分蘖型谷子分子标记辅助育种奠定了基础。