微卫星标记方法在大型猫科动物保护群遗传学研究中的应用与挑战

王 萌 朱思雨 薛茂盛 刘 霖 任迎丰 李立新 许 青 姜广顺*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.中国野生动物保护协会，北京，100029；3.国有济源市愚公林场，济源，454650)

猫科(Felidae)动物通常位于食物链的顶端，隶属于脊索动物门(Chordata)哺乳纲(Mammalia)食肉目(Carnivora)猫型亚目(Feliformia)。目前猫科动物分类尚存争议，《中国动物志》中将猫科动物分为28种，我国有6属13种[1]。猫科动物分布广泛，除澳洲和南极洲以外，世界大部分地区都有分布[2]。通常猫科动物分为大型和小型两类，代表了猫科动物早期的两个分支[3]。大型猫科具有不完全骨化的舌骨，舌骨中部具有弹性软骨；小型猫科动物具有完全固化的舌骨，所以它们能发出呜呜的猫叫声但不能发出大型猫科动物那样的怒吼声，熟知种类为家猫(Feliscatus)[1]。大型猫科动物通常指非洲狮(Pantheraleo)、虎(Pantheratigris)、豹(Pantherapardus)、美洲豹(Pantheraonca)和雪豹(Unciauncia)。同时，美洲狮(Pumaconcolor)和猎豹(Acinonyxjubatus)体型也较大，也被视为大型猫科动物[4]。作为顶级捕食者，大型猫科动物的存在基于整个自然界：通过改变草食动物对植物的影响，顶级捕食者可以对植物产生强烈的间接影响，而植被依赖于复杂的土壤结构以及构成生态系统的所有相互关联的生物[4-5]。顶级捕食者的存在可以调节该地区的生态系统，增加其稳定性[6]。

保护遗传学研究是野生动物保护工作中的重要组成部分。由于人类社会的盲目开采，资源匮乏严重威胁着野生动物的生存，许多野生动物仅残存于破碎的生境中。由于生境破碎化，种群隔离、基因交流中断、近亲繁殖等问题日益严重。由于以上原因保护生物学应运而生[7]。保护遗传学主要包括种群遗传学，分子生态学，分子生物学，进化生物学等学科[8]。随着分子遗传学技术的不断发展，野生动物保护遗传学的方法日益增加。目前应用较广的方法主要有生物芯片标记技术[9-11]、随机扩增多态性(RAPD)标记[12]、扩增片段长度多态(AFLP)标记[13]、微卫星标记方法[14-16]等。取得样品时，多采用非损伤性取样方法[17-18]。野生动物保护遗传学的研究内容，目前主要集中于遗传多样性[19-20]、种群结构[21]、个体识别[22-23]等方面。微卫星标记作为保护遗传学中应用极其广泛的方法，具有多态性高，稳定性高等诸多优点，并且由于发生变异较频繁，尤其适用于较短时间内发生的遗传分化以及遗传多样性分析，在越来越多的研究中都有使用。

对于大型猫科动物的研究目前主要分野生种群和圈养种群的研究。野生大型猫科动物通常为独居动物，极少群居，并且具有易躲避人类的习性，野生种群的研究通常具有极度的偶然性。对于野生动物的研究通常集中于生态研究、保护遗传学、种群监测等方面。随着保护遗传学的发展，越来越多的遗传学方法可以应用于野生大型猫科动物的监测保护中。

1 微卫星方法的研究进展

卫星DNA由长串联重复序列组成，根据重复单位的大小，可分为卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA 3种[24]。微卫星标记，具有高稳定性、高多态性、引物通用性、位点特异性、检测方便和呈共显性遗传等特点，是广泛应用于动物遗传多样性分析、遗传图谱构建、雌核发育、基因定位及克隆、亲权鉴定等的理想分子标记[25]。

1.1 微卫星标记的开发

传统方法中，微卫星位点已从目标物种的部分基因组文库中分离出来。微卫星从目标物种基因文库分离出来后，根据DNA片段的长度、待发现的微卫星重复单元以及片段末端的类型选择限制酶，通过探针杂交将目的克隆片段从数千个菌落中分离出来[26]。这种方法虽然操作简单，但是对于微卫星频率低的物种，该方法效率极低[27]。另一些人提出利用RAPD引物进行PCR扩增未知微卫星位点后利用微卫星探针进行Southern杂交[28-29]。目前，常用于大型猫科动物种群遗传学的位点多为应用此种方法开发的[30-31]。FIASCO法是另一种开发微卫星标记的方法，相较于之前的方法，FIASCO方法利用AFLP方法标记，效率大为提高[27]。Zhang等曾利用此种方法开发11个应用于华南虎(Pantheratigrisamoyensis)的微卫星位点引物，在57个个体中进行扩增，除一个位点无多态性，其余位点含有4—9个等位基因[32]。

目前，高通量测序方法已经广泛应用，许多微卫星标记的开发，也使用到了高通量测序的方法。利用高通量测序方法进行微卫星标记开发，具有高效、便捷、准确的特点[33]。万冬梅等利用高通量测序开发沼泽山雀(Poecilepalustris)微卫星位点，最终成功搜索出2 471个微卫星位点[34]。

1.2 微卫星标记研究概况

微卫星标记在众多领域都有许多应用，在对于野生动物的种群数量、遗传多样性、遗传结构的研究中越来越多地依赖微卫星标记技术。除此之外，在育种、医疗、法医等领域微卫星标记技术也有广泛的应用。在对于大熊猫的研究中，目前以论文形式公开发表的大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)微卫星标记已有109个，利用这些微卫星标记，大熊猫的种群数量、遗传多样性、种群结构等诸多方面进行了深入的研究[35]。对于栖息于芬兰的棕熊(Ursusarctos)的研究中，通过基因流研究并与俄罗斯、瑞典和挪威种群的遗传组成进行对比，发现俄罗斯的棕熊大量迁入东部种群，加速了东部种群的恢复[36]。

育种方面，微卫星标记常用于监测种群结构以及遗传潜力[37]。医学方面，微卫星不稳定性(MSI)与癌症易感基因以及预后的关系为近年来的研究热点[38-39]。法医方面，通过对现场被害人或罪犯遗留的血痕、精斑、毛发、骨骼等人体材料做出个人识别或同一性鉴定[40]。

2 利用微卫星方法对于大型猫科动物进行遗传学研究

野生大型猫科动物难以捕捉，通常将非损伤性取样方法与微卫星标记方法相结合，以便在不伤害野生动物的情况下获得其遗传样本，并监测其种群遗传多样性，种群结构等相关遗传参数。

2.1 非损伤性取样方法

采用非损伤性取样方法，可以从脱落的毛发及羽毛中，粪便、尿液中，甚至蛋壳中提取到DNA[41]。粪便样品相较于其他非损伤性样品具有较多优点。粪便样品具有可获得性高，可识别度高，不干扰动物正常活动，安全，DNA含量较大，可获得多元遗传信息等优点[42]。采集后可以对其进行物种分布、食性、性别、个体以及数量、种群密度进行鉴别及估算[43]。

目前粪便中DNA提取相较于肌肉DNA、肝脏DNA来说质量较差，成分复杂，不仅含有目标物种肠道脱落细胞，还含有大量的肠道微生物、食物残渣、酶、脂类、蛋白质、多糖等代谢物质。未提取时容易被粪便中微生物降解，对于储存有较高要求[44-46]。并且在基因分型时容易无PCR产物或获得错误基因分型[47-50]。但是研究野生动物遗传，尤其是濒危野生动物，如大熊猫、虎、熊等的遗传学研究中，非损伤性取样仍然是主要取样方法[17-18，51-52]。通过严格的试验技术、适用于粪便DNA位点的筛选，粪便DAN样品的弊端大为减少。Zhang等[53]收集黑龙江省东北虎林园的虎血液以及粪便样品并提取DNA，血液DNA作为阳性对照进行12个微卫星位点的扩增，发现其中8个微卫星位点能稳定扩增，适合用作东北虎(Pantheratigrisaltaica)粪便DNA的研究。随着非损伤性取样法的局限性逐渐被打破，使用范围不断扩大，结合微卫星等标记技术，通过分析非损伤性遗传样本中的核DNA，能够进行个体鉴定、亲缘关系判定、谱系重建、性别鉴定和种群数量评估，这对野生动物种群监测具有重要意义[25，30，54]。

2.2 微卫星标记方法在大型猫科动物研究中的应用

2.2.1 微卫星标记

目前大型猫科动物微卫星标记多借用家猫微卫星标记。这些标记位点最初由Marilyn等[30]设计，后来逐步用于大型猫科动物，尤其是虎的保护遗传学，大多都选用了其中一些位点进行研究。在对于Primorye Krai地区东北虎的研究中同样选取这些引物中的10个在东北虎物种具有多态性的位点，识别出12只个体并估测2002—2003年有9—19只个体栖息于此[55]。对其中一些位点进行修饰后可设计多重分型体系，应用于大型猫科动物的研究，减少工作量之余还可减少对模板DNA的消耗[56]。在选择标记位点时，选取这些位点与其他大型猫科动物的微卫星位点甚至线粒体位点共同使用也广泛应用对大型猫科动物的研究[56]。

除此之外，还有为某些特定物种大型猫科动物的引物也被证明在其他大型猫科动物中同样具有多态性得到了广泛应用，如苏门答腊虎(Pantheratigrissumatrae)设计的微卫星位点引物，被证明在东北虎、豹、狮子上同样具有多态性[31，57]。为孟加拉虎(Pantheratigristigris)研究设计的微卫星标记位点，在随后的其他虎例如东北虎的研究中也有应用[53，58]。

2.2.2 种群数量调查

通过个体识别可了解野外种群的大小，是保护工作的重点和基础，只有了解种群大小，才能制定合理的保护计划。利用粪便DNA使用微卫星标记对大型猫科动物野生种群遗传学监测在世界各地的保护区以及国家公园都有应用。在印度西高止山脉的虎豹种群数量研究中，通过粪便DNA识别出18只虎和39只豹[59]。尼日利亚Yankari Game 保护区和Kainji Lake国家公园内自2008至2010年收集狮子的粪便样本进行个体识别以及遗传多样性监测，在来自Yankari Game 保护区的样品中识别出10只个体(7只雄性，3只雌性)，Kainji Lake国家公园的样品中识别出8只个体(2只雄性，3只雌性，2只未知)[60]。Rozhnov 等[61]利用保护遗传学方法分析了Primori西南部东北豹(Pantherapardusorientalis)的种群结构，2010—2012年收集的样品中鉴别出23只个体，并分析了其种群遗传结构。Wang等[43]在珲春国家级自然保护区收集55份东北虎粪便样品以及一份毛发样品，从中鉴定出7只个体(2只雄性，4只雌性，1只性别未知个体)，同时还发现中国东北虎种群遗传多样性低于俄罗斯东北虎种群遗传多样性，可能是中国东北虎种群较小而导致的。通过个体识别了解种群大小、性别比例等，可以结合种群遗传多样性参数对种群未来发展进行一定的预测。

2.2.3 遗传多样性检测

遗传多样性是指种内基因的变化，亦称为基因多样性。种内的多样性是物种以上各水平多样性的重要来源[62]。种群遗传多样性是遗传多样性的重要体现，表现了一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力。遗传多样性越高，该群体对于环境的适应能力就越强，更容易在变化的环境中生存[63]。Wu 等[64]利用16个家猫微卫星引物以及4个苏门答腊虎微卫星引物对20只动物园繁殖东北虎进行遗传多样性以及亲缘关系检测，发现这些东北虎杂合度高，并且遗传多态性高。津巴布韦Savé Valley保护区收集样品进行种群遗传学监测，该保护区种群2005年曾减少到5—10只个体，重新引入10只个体后2016年已经恢复到200只以上。利用11个微卫星位点识别出42个个体，虽然个体数量较多，但遗传多样性较低，出现了近交现象，需要再次引入个体[65]。通过种群遗传多样性的研究可对种群遗传的基本情况有所了解，对于制订保护计划也十分重要。

2.2.4 种群遗传结构分析

目前，大多数猫科动物都面临着栖息地破碎化这一严峻的生态问题，栖息地破碎化是许多保护问题的根源所在。栖息地破碎华对于其居于其中的动物影响最严重的就是破碎的栖息地阻止了基因交流，遗传丰富度降低，廊道和景观连通可以改善这种情况[66]。Sorokin 等[58]使用分损伤性取样方法进行分子遗传分析在Ussuriskii国家保护区、Udegeyskaya Legenda国家公园和Khabarovskii Krai收集样品，利用9个微卫星标记位点从256份粪便样品、7份毛发样品、11份血液样品中识别出63只东北虎个体，并进行种群遗传结构分析。来自Khabarovskii Krai的样品和Udegeyskaya Legenda国家公园的样品属于同一种群，而来自Ussuriskii国家保护区的样品属于另一种群。对于猎豹进行种群遗传学调查中，利用14个微卫星标记位点，发现博茨瓦纳不同地区的猎豹之间存在着一定的遗传分化，并且雄性比例高于预期[67]。Wultsch等[68]选取5个取样点采集美洲豹、美洲狮和豹猫(Prionailurusbengalensis)样品共计1 053份利用14个微卫星位点扩增进行遗传监测，观察到3个物种均显示出遗传分化，表明栖息地破碎化已对这3种动物的基因交流产生了影响。Terai 景观弧跨越印度与尼泊尔两国，两国均对本国境内景观弧区域孟加拉虎种群进行了遗传结构分析。印度区域内收集孟加拉虎遗传样品71份，利用13个微卫星位点进行扩增，发现该区域内两个保护区中孟加拉虎种群基因流受阻，已经产生分化，需采取措施减少人为干扰[69]。尼泊尔区域内的孟加拉虎进行种群遗传分析，收集该区域内5个保护区以及6个可能的廊道中412份孟加拉虎遗传样品，利用8个微卫星标记识别出78只个体，这些个体中有3—7只具有移动性，形成了3个遗传种群并具有中度分化，基因流同样受阻，需进一步规划对Terai 景观弧进行保护以加强基因流动[70]。由以上文献可以发现由于栖息地破碎化，几乎所有大型猫科动物的基因交流都受到了阻碍，产生了遗传分化。加强廊道的保护，减少栖息地破碎化对于基因交流的影响对于大型猫科动物保护十分重要。

3 未来应用与挑战

微卫星标记技术在猫科动物的保护工作中使用十分普遍，具有不可替代的地位。在监测野生动物种群遗传多样性、种群大小、种群结构以及诸多其他方面均发挥有重要作用。微卫星标记的方法具有诸多优点，但是应用中仍有一些缺陷。首先，虽然微卫星扩增片段有许多短片段，但是在野生动物的研究中分型成功率并不高[70]，主要是因为粪便样品DNA浓度低，并且在含有食物以及微生物的DNA以及其他杂质。其次，微卫星位点的选择颇多，许多针对相同物种的研究选取的微卫星位点仅有少量相同而不能进行充分的结果比较[43，51，58-59]。目前大型猫科动物使用的微卫星标记多为二碱基重复，在PCR过程中易发生滑动而现错误[71]，需要每批次分型时设置可以稳定扩增的样品进行矫正。即使选择相同位点，没有矫正样品的数据也不能合并分析。并且，目前微卫星分型没有统一的标准，分型结果也不能如同DNA序列一样上传至数据库共享数据。缺乏数据的可比性严重制约了微卫星标记的应用。

目前已有许多针对粪便DNA提取与保存的研究[72-73]，随着提取DNA方法的改进，粪便样品DNA扩增成功率将大为提高。二代测序技术已经趋于成熟，许多大型猫科动物的基因组序列也已经发表，位点筛选的工作量与传统方法相比将大为减少[74-75]。设计扩增目的片段更短的四碱基重复片段将大为减少滑动而出现的错误[76]。另外，进一步统一分型标准也将增进微卫星分型数据的可比性。

现有的研究已有许多微卫星标记结合其他研究方法。结合线粒体DNA标记进行研究，相比于单纯使用微卫星标记，具有更高的可信度，常用于种群遗传监测以及构建进化树的研究中[57]，结合宏观生态学数据如空间地理坐标可以研究如遗传距离与地理距离的关系[77]。未来在大型猫科动物的研究中，使用单一微卫星标记方法所提供的信息已不能满足对于大型猫科动物种群的研究，结合其他标记方法将成为微卫星标记研究的主要方向，如结合对粪便进行食性研究可监测个体取食情况，结合粪便中各项生化指标监测个体的激素水平等。针对不同的目的选择合适的方法与微卫星标记相结合，可以更好地监测野生动物种群动态。