薯蓣素抑制口腔鳞状细胞癌的机制研究*

李明，赵卿，高峰

(1.湖南省长沙市口腔医院,湖南 长沙 410004；2.中南大学湘雅三医院 超声科,湖南 长沙 410013)

口腔癌是世界第6大致死性恶性肿瘤，其中约90%为口腔鳞状细胞癌，近年来口腔癌发病率呈逐年升高趋势。来自流行病学及临床与基础研究的多方证据表明，口腔鳞状细胞癌与长期的化学致癌物（如烟草中的尼古丁、焦油、酒精），物理致畸变因素暴露，及病毒感染（人乳头状瘤病毒）等密切相关。由于口腔鳞状细胞癌发病机制复杂，目前仍没有特定的分子靶向药物应用于临床。手术切除，结合局部放疗和化疗仍是口腔鳞状细胞癌的主要治疗手段。由于口腔鳞状细胞癌具有极易早期转移的临床特征，口腔鳞状细胞癌患者的5年生存率仍不足50%[1-3]。因此，阐明口腔鳞状细胞癌的发病机制，寻找有效的药物靶点或研发新型抗肿瘤药物仍是目前研究的热点。

小分子化合物由于其特有的低毒副作用，多年来备受抗肿瘤药物筛选及研发的青睐。天然产物薯蓣素已被证实具有广谱的体内外抗肿瘤活性。薯蓣素可以通过抑制多条蛋白激酶信号通路及多个转录因子的功能，阻断肿瘤赖以生存与生长的重要生物大分子的功能，从而抑制肿瘤的发生发展[4-6]。但薯蓣素抗口腔鳞状细胞癌的分子机制及其潜在靶点还不清楚。本研究以人口腔鳞状细胞癌TSCCa和TCA8113为研究模型，探讨薯蓣素对其增殖存活的抑制作用及其潜在的分子机制。

1 材料与方法

实验用人口腔鳞状癌细胞TSCCa和TCa8113购自中南大学医学细胞中心。

1.1 主要试剂和抗体

薯蓣素（Dioscin，纯度＞97%）购自美国Selleck公司，分子量869.04 g/mol。DMEM细胞培养基和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自美国Gibco公司 ,免疫印迹抗体 [包括 HK2（#2867）、PFK（#8164）、PKM2（#4053）、PARP（#9532）和 Cleaved-Caspase3（#9664）]购自美国Cell Signaling Technology公司，Glut1（ab15309）购自美国Abcam公司，β-actin（A5316）抗体购自美国Sigma公司，MTS试剂Cell Titer 96® AQueous One Solution购买自美国Promega公司，Flag-HK2过表达质粒购自美国Origene公司。

1.2 MTS实验和软琼脂集落形成实验检测薯蓣素对口腔鳞状细胞癌增殖的影响

将TSCCa和TCa8113细胞消化计数后，按照3 000个/（孔·100 μl）密度接种于96孔板。24 h后，更换含有不同浓度薯蓣素的新鲜培基至96孔板中，在薯蓣素处理后的不同时间点（24、48及72 h）加入20 μl的MTS试剂至96孔板中，并在细胞培养箱中孵育2 h，酶标仪（美国Bio-Rad公司）检测490 nm处吸光度值。

将配制好的2×BME培养基和1.25%琼脂凝胶放置48℃水浴锅中保温备用。取70 ml预热的2×BME，18 ml 1×PBS，18 ml FBS，2 ml L-Glutamine，100 μl Gentamicin以及72 ml 1.25%琼脂凝胶混匀后即为下层琼脂凝胶混合液，放置48℃水浴锅保温备用。将不同浓度的薯蓣素和下层琼脂凝胶混匀后3 ml/孔迅速加入6孔板中，并放置在超净台充分凝固。将TSCCa和TCa8113细胞消化计数后，用1×BME稀释成30 000个/ml细胞悬液。取2.4 ml下层凝胶并与1.2 ml细胞悬液及不同浓度的薯蓣素混匀后，1 ml/孔加入含有下层凝胶的6孔板中，待琼脂凝胶完全凝固后，将6孔板放置培养箱中孵育2周，显微镜拍照并统计克隆数。

1.3 蛋白质免疫印迹检测薯蓣素对口腔鳞状细胞癌糖酵解调控蛋白及凋亡调控分子表达的影响

离心收集薯蓣素处理24 h后的TSCCa和TCa8113细胞，加入300 μl RIPA（25 mmol/L Tris.HCl pH 7.6,150 mmol/L NaCl, 1% NP-40，1% sodium deoxycholate）细胞裂解液冰上裂解30 min，超声粉碎15 s，13 000 r/min离心15 min，上清即为全细胞裂解液。用BCA试剂盒定量蛋白浓度，取30 μg蛋白进行免疫印迹分析。蛋白在SDS-PAGE电泳中分离并转移至PVDF膜。将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭过夜。次日加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min。X射线曝光、显影、定影。

1.4 葡萄糖摄取及乳酸生成效率检测

取1×106个细胞接种于6孔板，培养箱孵育6 h后，更换含有不同浓度薯蓣素的新鲜培养基，细胞在培养箱内继续培养8 h。收集细胞培养上清，全自动临床生化检测仪检测细胞培养上清内葡萄糖和乳酸浓度。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，不同时间点和组间的比较采用方差分析或t检验，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 薯蓣素对口腔鳞状细胞癌增殖的影响

MTS结果显示1 μmol/L薯蓣素处理细胞24 h并不能抑制TSCCa和TCa8113细胞的生长。薯蓣素对TSCCa和TCa8113细胞72 h的IC50值分别为3.65和3.02 μmol/L。随着时间延长，1 μmol/L薯蓣素处理72 h后能抑制这2株细胞的增殖。随着薯蓣素浓度升高，在24 h时 5 μmol/L薯蓣素即开始抑制TSCCa（F=1.518，P=0.00042）和TCa8113细胞的增殖（F=1.518和1.777，P=0.00042和0.00032），72 h时，5 μmol/L薯蓣素对细胞增殖的抑制率达到80%，薯蓣素处理组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

为进一步证实薯蓣素对口腔鳞状细胞癌的抑制作用，笔者采用软琼脂克隆形成实验检测薯蓣素对口腔鳞状细胞癌克隆形成能力的影响。与MTS结果一致的是，薯蓣素呈剂量依赖性抑制TSCCa和TCa8113细胞克隆的形成，差异有统计学意义（F=14.094和21.341，均P=0.000）。5 μmol/L薯蓣素几乎完全阻断这2株细胞的克隆形成（P＜0.05）。见图2。

图1 薯蓣素对TSCCa和TCa8113细胞增殖的影响

图2 薯蓣素对细胞停泊非依赖生长的影响

2.2 薯蓣素对有氧糖酵解的影响

对薯蓣素处理前后口腔鳞状细胞癌葡萄糖摄取能力的检测发现，薯蓣素抑制TSCCa和TCa8113细胞对葡萄糖的摄取，该抑制作用具有剂量依赖性。与对照组比较，5 μmol/L薯蓣素下调了TSCCa细胞65%和TCA8113细胞75%的葡萄糖摄取效率，差异有统计学意义（F=2.866和3.874，P=0.001和0.000）。且这2株细胞的乳酸生成也下调。5 μmol/L薯蓣素抑制TSCCa细胞近50%和TCa8113近70%的乳酸生成量，与对照组比较，差异有统计学意义（F=2.246和2.234，均P=0.000）。见图 3。

薯蓣素剂量依赖性抑制TSCCa和TCa8113细胞内ATP水平，差异有统计学意义（F=1.987和2.194，P=0.001和0.000）。见图4。

2.3 薯蓣素对葡萄糖转运蛋白Glut1和己糖激酶HK2表达的影响

薯蓣素抑制Glut1和HK2蛋白的表达，并不能抑制PFK和PKM2蛋白的表达。见图5。

2.4 薯蓣素对凋亡相关分子活化的影响

图3 薯蓣素对口腔鳞状细胞癌糖酵解的影响

图4 薯蓣素对口腔鳞状细胞癌ATP水平的影响

图5 薯蓣素对Glut1和HK2表达的影响

免疫印迹结果表明，薯蓣素抑制HK2表达的同时，促进凋亡调控相关蛋白Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切活化。低浓度薯蓣素只能轻微抑制HK2的表达，Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切体活化并不明显。随着浓度升高，5 μmol/L薯蓣素能促进Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切体表达。见图6。

2.5 过表达HK2对薯蓣素诱导细胞凋亡的影响

图6 薯蓣素对口腔鳞状细胞癌PARP、Caspase-9和Caspase-3剪切体形成的影响

图7 过表达HK2对薯蓣素诱导细胞凋亡的影响

与前期结果一致的是，2 μmol/L薯蓣素能促进Caspase-3和PARP剪切体的表达上调。过表达HK2后，能抑制薯蓣素诱导的Caspase-3和PARP剪切体表达。见图7。

3 讨论

有氧糖酵解异常是肿瘤细胞重要生物学特征之一。研究发现，即使在供氧充足的情况下，肿瘤细胞仍倾向于利用有氧糖酵解的方式将葡萄糖分子不完全氧化生产乳酸来为细胞供能，该现象被称为“温伯格效应”[7]。有氧糖酵解不仅能为肿瘤细胞提供充足的能量供给，其葡萄糖不完全氧化所生产的中间产物更为快速增殖的肿瘤细胞提供了生物大分子合成所必需的原料。己糖激酶HK2作为催化葡萄糖向葡萄糖6磷酸转化的蛋白激酶，也是糖酵解过程中第一个限速酶。目前共发现4种己糖激酶亚型，包括HK1、HK2、HK3和HK4，但只有HK2被证明在多种人肿瘤细胞中异常高表达[8]。HK2已被证实在人肝癌、肺癌、乳腺癌和食管癌等多种肿瘤内高表达，HK2过表达不仅满足肿瘤细胞快速增殖而对能量的需求，更促进肿瘤细胞的放化疗耐受及死亡逃逸，肿瘤组织内高表达HK2提示着预后不良[9-10]。本研究发现，天然产物薯蓣素能抑制口腔鳞状细胞癌TSCCa和TCa8113细胞的增殖及克隆形成。进一步研究发现，薯蓣素对TSCCa和TCa8113细胞的抑制作用与其下调肿瘤细胞的糖酵解及HK2的表达有关。虽然薯蓣素在胞内具有多个潜在的分子靶点，如抑制肿瘤相关蛋白激酶的活化，下调肿瘤相关转录因子的入核等，但薯蓣素对肿瘤细胞代谢的影响还未见研究报道。本研究首次证实，薯蓣素可以通过下调HK2表达及有氧糖酵解而抑制口腔鳞状细胞癌。该结果提示，靶向抑制HK2的表达/活性，或抑制HK2介导的有氧糖酵解可能为口腔鳞状细胞癌的临床治疗提供新的药物作用靶点或开创新的肿瘤诊疗手段。

研究表明，HK2作为线粒体外膜表达蛋白，在控制线粒体电势稳定性和细胞凋亡方面具有重要的生物学功能[11]。异常高表达HK2促进肿瘤细胞对不良环境因素的抵抗及细胞死亡信号的相对不敏感。共同靶向HK2介导的有氧糖酵解和细胞自噬促进前列腺癌细胞的死亡[12]。HK2在线粒体外膜通过与电压依赖性阴离子通道VDAC相互结合而稳定线粒体电势。抑制HK2的线粒体表达能有效促进非小细胞性肺癌的凋亡[13]。本研究发现，薯蓣素下调HK2的表达，并诱导TSCCa和Tca8113细胞的凋亡。进一步研究表明，薯蓣素诱导的细胞凋亡是HK2表达下调依赖的，过表达HK2有效抑制薯蓣素诱导的细胞凋亡。本结果提示，HK2对促进口腔鳞状细胞癌的存活具有重要的作用，薯蓣素诱导的口腔鳞状癌细胞死亡是否与HK2表达下调而导致的线粒体电势紊乱有关还有待进一步研究证实。

靶向抑制有氧糖酵解或糖酵解的关键限速酶对促进肿瘤细胞的死亡或放化疗增敏具有重要的作用。研究发现，多种天然产物可以通过抑制肿瘤细胞内HK2的表达及下调有氧糖酵解而发挥其抗肿瘤功能。如白藜芦醇、鱼藤素通过抑制HK2而促进非小细胞性肺癌凋亡等[13-14]。笔者前期研究发现，EGCG能抑制HK2的表达并促进口腔鳞状细胞癌细胞凋亡[15]。结合本研究结果，提示HK2高表达或上调有氧糖酵解可能对口腔鳞状细胞癌的发生、发展具有重要作用。本研究不仅丰富了小分子化合物薯蓣素抗肿瘤的新机制，更为靶向抑制HK2或有氧糖酵解的口腔鳞状细胞癌临床治疗提供了前期的研究基础。