Rv0220蛋白IFN-γ释放试验对结核潜伏感染的诊断价值研究
2019-05-22
结核潜伏性感染(latent tuberculosis infection，LTBI)是指生物体在感染结核分枝杆菌后未发病，且无活动性结核的临床病症表现、影像学改变等症状的一种特殊状态。在潜伏感染期间若得不到及早的诊断和治疗，感染人群将会有5%到10%的可能性会发展为活动性结核，进而发生进一步的传播[1]。目前，结核病诊断方法主要有痰涂片镜检法、血清学诊断、结核菌素皮肤试验及MTB核酸扩增检测等，但其普遍存在培养时间长，敏感性、特异性差，易发生交叉反应造成假阴性等缺点[2-5]。目前商品化试剂盒如胶体金法试剂盒TB38-16KD，其基于重组抗原组合用于血清学的诊断，但在临床检验中并不能诊断潜伏期结核。
结核菌γ-干扰素体外释放试验(interferon-gamma release assay of MTB，TB-IGRA)指在体外采用MTB抗原刺激特异性T细胞免疫应答，现近年来，以结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)的RD区抗原为刺激原的γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(IGRA)已经用于MTB感染的诊断，且被证实有较好的特异性和灵敏性[6-10]。为确定结核分枝杆菌在IGRA实验中对结核潜伏性感染有效诊断抗原，急需筛选具有高检出率的MTB特异抗原蛋白。越来越多的证据表明，细菌细胞壁或表面定位酶可作为抗原蛋白引起宿主细胞的免疫反应[11-13]。在本研究中，我们使用了一种特殊的抗原蛋白RV0220，并探讨了它用于IGRA对结核潜伏性感染的诊断价值。RV0220是基于共有基序GXSXG存在的家族成员，是一种酯酶，并且是存在于MTB细胞壁和荚膜中的细胞表面蛋白，能够引发促炎性细胞因子在肺上皮细胞和巨噬细胞中的产生[14]。
本文研究了112例临床样本外周血特异性γ-干扰素反应，使用目前IGRA广泛使用的已商品化的ESAT-6、CFP-10、TB7.7三种抗原蛋白(以下简称ECT)混合后进行IGRA试验作为结果对照，现将Rv0220作为IGRA刺激原对临床样本血清的结核潜伏性感染诊断价值研究报道如下。
1 材料与方法
1.1样本、菌株与主要试剂 临床样本血清来源于新疆喀什结核病防治中心(肺核医院)体检血样。人结核杆菌感染血清、结核分枝杆菌及PET-28a质粒、大肠杆菌等均为本实验室保存。人淋巴细胞分离液、刀豆蛋白A、IGRA商品化试剂盒等均购于北京索莱宝生物技术有限公司。以上材料符合我院伦理标准。
1.2Rv0220抗原蛋白的原核表达及western blot检测 通过PCR扩增Rv0220基因构建pET28a(+)-Rv0220重组质粒，转化大肠杆菌EscherichiacoliDE3，用异丙基硫半乳糖苷(IPTG，1 mmol/L)在37 ℃条件诱导6 h，收集细胞。诱导表达的菌液经超声仪破碎后加入结合缓冲液(按照Hi Trap FF Ni离子亲和层析说明书操作)上层析柱，用洗脱缓冲液洗脱。将峰值洗脱产物收集后，经SDS-PAGE电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭过夜，以结核分枝杆菌感染阳性血清以1∶50稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG以1∶8 000稀释作为二抗进行Western blot检测。以二氨基联苯胺(DAB)作为显色剂，显色1 min后，用去离子水终止反应。
1.3γ-干扰素体外释放试验 取24孔板，每一份检测样品分为3个实验孔，在每个孔内依次加入RPMI-1640细胞培养液，阴性对照孔加入PBS，终浓度为10 μg/mL，3个实验孔样品依次为ECT蛋白溶液、Rv0220蛋白溶液和刀豆蛋白A(Con A)各100 μL，终浓度均为10μg/mL，然后在每个反应孔内加入2.5×106/mL 的T淋巴细胞(外周血样分离所得)400 μL，使每个孔的细胞数量及液体体积相等，混匀，于37 ℃、5%的CO2培养箱内培养18～22 h。用无菌离心管(无内毒素、无RNA酶)收集每个实验孔的液体，3 000 r/min离心15 min，收集上层液体标记后-20 ℃保存。通过ELISA方法测定γ-干扰素含量，此过程严格按照IGRA商品化试剂盒说明书进行测定。
1.4γ-干扰素标准曲线的建立 将人IFN-γ标准品稀释依次为0 pg/mL、12.5 pg/mL、25 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL置于实验孔内，每个样品4次重复。空白孔中不含液体。加入50 μL的IFN-γ抗体，37°C孵育1 h。洗涤后，每孔加入50 μL的着色剂A和B，在37 ℃下孵育15 min后加入终止溶液，10 min内测定样品在450 nm处的吸光度。用Prism7软件将标准品浓度作为横坐标、OD450nm值作为纵坐标得出拟合方程，在该方程中找出相关系数>0.99的线性范围作线性标准曲线，见图3。根据标准曲线计算T、N、P组的IFN-γ含量。IFN-γ释放结果依据万泰IGRA-TB试剂盒提供的判断方法进行，见表1所示。
表1 IGRA试验结果判定标准
Tab.1 Criteria for determination of IGRA test results
阴性对照阳性对照-阴性对照测试孔-阴性对照结果判定≤400任何值≥14且≥N/4阳性≥20<14阴性≥20≥14但≤N/4不确定<20<14不确定<20≥14且
1.5统计学处理 使用SPSS17.0进行数据统计学分析，P<0.05差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1Rv0220抗原蛋白表达纯化与Western blot免疫性检测 用IPTG诱导PET-28a Rv0220 DE3表达载体，并用Ni离子亲和层析法纯化。用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析。蛋白质的分子量约为47 kDa，与预期值一致，纯化蛋白仅作为一条带出现。见图1，表明Rv0220蛋白在大肠杆菌中表达成功。以TB阳性血清1∶50稀释液为第一抗体，羊抗人IgG HRP(1∶8 000稀释液)为第二抗体进行Western印迹鉴定，证明RV0220具有良好的免疫反应性(图略)。
M：蛋白质分子质量标准；a：未诱导大肠杆菌DE3；b：PET-28a载体；c：超声破碎后的上清液；d：超声破碎后的包涵体；e：纯化后的Rv0220蛋白图1 Rv0220蛋白SDS-PAGE电泳分析Fig.1 Rv0220 protein SDS-PAGE electrophoresis
2.2 Rv0220蛋白IGRA检测
2.2.1人IFN-γ浓度标准曲线的建立 IFN-γ标准品浓度浓度分别为12.5 pg/mL、25 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL加入IFN-γ抗体测定450nm处的吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标得到线性标准品的方程为y=0.002 882x+0.139 3，R2=0.994，具有较高的相关系数，见图3。
图3 人IFN-γ浓度标准曲线Fig.3 Standard curve of human IFN- gamma concentration
2.2.2Rv0220蛋白IGRA检测灵敏性与特异性 用刀豆蛋白 A作为阳性对照刺激各组淋巴细胞，均可引起IFN-γ释放，表明各组细胞免疫功能正常。对两组抗原引发T细胞反应分泌IFN-γ水平进行显著性分析。结果表明，以ECT抗原组合作为对照，Rv0220蛋白在刺激IFN-γ释放水平上均无显著性差异(P>0.05)，相关系数r>0.5，表明Rv0220抗原诱导细胞免疫的能力基本与ECT组合保持一致，且与ECT组合具有较高的相关性。以ECT检测结果为参照，Rv0220蛋白检测临床样本灵敏性为72.73%，特异性为100%，阳性预测值为72.73%，阴性预测值为40%。见表2。
表2 Rv0220蛋白IGRA检测灵敏性与特异性结果
Tab.2 Sensitivity and specificity of Rv0220 protein IGRA detection
样本量ECTRv0220灵敏性特异性112阳性阴性不确定阳性阴性不确定72.73%100%8816864(64)40(16)8(8)
()表示Rv0220检测结果与ECT检测结果相同的样本数。
3 讨 论
近年来，γ-干扰素释放试验在结核病的临床诊断中广泛应用。与其他试验相比，IGRAs能够高效地分离卡介苗接种人群以及其他非致病性分枝杆菌的感染，为结核病的治疗提供指导，并且整个试验过程费时短，敏感性和特异性较高。其原理是基于T淋巴细胞的免疫应答过程。T细胞接触结核分枝杆菌的特异性抗原，当再次接触结核分枝杆菌的特异性抗原(如TB7.7等)时,T细胞将分化成为效应T细胞并且会释放多种细胞因子，其中包括变化水平高的IFN-γ，由此可以通过IFN-γ含量变化或者释放IFN-γ 的T淋巴细胞的数量来检测生物个体是否感染结核分枝杆菌。根据Meta研究结果，IGRAS在结核病临床检测中的敏感性与特异性较高，分别在78%～100%和87.5%～100%之间[15-16]。Park HJ等发现，在发展比较落后且结核病高发地区，IGRAs的检测效果与TST相差不大[17-18]。由于不同人群中leukocyte antigen的高度多态性和不同人群的细胞免疫水平不同，所以抗原引起的T细胞免疫强度不同，以至于对不同国家和地区的检测敏感性和特异性存在差异。因此，在刺激抗原的基础上筛选适合我国人群的IGRA刺激抗原对结核的潜伏性感染诊断具有重要意义。
本实验采用亲和层析方法纯化Rv0220蛋白，并通过 Western blot验证这种蛋白具有良好的抗原反应性。基于上述原理，通过对临床无症状样本外周血的IGRA检测，以现广泛应用并以商品化的ESAT-6、CFP-10和TB7.7混合蛋白组合为对照，得到Rv0220对临床样本的IGRA检测灵敏性为72.73%，特异性为100%，虽然有较高的灵敏性与特异性，但结果出现较多假阴性与不确定现象，有可能是患者长期服用免疫抑制药或免疫功能低下的结果。 此外，T细胞的活性对IFN-γ的释放同样具有重要影响。通过Rv0220与三种广泛应用的抗原蛋白的检测结果的比较，Rv0220蛋白在IFN-γ释放水平上与对照抗原无显著性差异，且具有较高的相关性(r>0.5)，对于结核的潜伏性感染检测具有重要的应用价值，且IGRA在肺结核、活动性肺结核、陈旧性肺结核、特殊人群肺结核中的检测有较好的灵敏度与特异性[19-20]，为IGRA新型刺激抗原的筛选和对于其他类型结核的研究奠定了基础。
利益冲突：无
本文引用格式：王霜珏, 姬祥, 张倩, 等. Rv0220蛋白IFN-γ释放试验对结核潜伏感染的诊断价值研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(4): 315-319. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.029
