炎症及细胞自噬与急性肺损伤关系的研究进展①

孙 健 沈巨信

(绍兴市人民医院呼吸内科，绍兴312000)

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是由各种肺内、外致病因素导致的急性、弥漫性炎症性肺损伤，进而引起急性呼吸衰竭的临床综合征[1]。ALI是常见的呼吸危重症之一，在重症监护病房，其病死率高达40%～50%[2,3]。ALI病因复杂，确切的发病机制未明。但目前认为，肺内炎症细胞的过度活化、募集，失控性地释放炎性因子，是急性肺损伤的根本原因，而不依赖其特定的病因[1]。多种炎症细胞因子参与了ALI发生和发展，其中，IL-1β与TNF-α是两个关键的细胞因子，由于其具有进一步触发其他促炎细胞因子分泌的作用，故又被称为“早期反应细胞因子”。研究显示，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3)炎性体(NLRP3 inflammasome)是调控IL-1β成熟和分泌的关键分子结构。新近研究还发现自噬能抑制炎性体及其关键效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)的活化，减少IL-1β等炎症因子的释放。由此提示，针对NLRP3炎性体及自噬的治疗有可能成为防治ALI的靶点之一。本文就炎症与自噬对ALI作用的研究进展做一综述。

1 炎症与急性肺损伤

1.1炎性与天然免疫 炎症反应是机体遭受创伤、感染等外源性及内源性刺激后的一种防御性反应,可通过激活天然免疫和获得性免疫应答恢复机体的动态平衡[4]。天然免疫是机体防御病原体的第一道防线，主要通过模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRRs)来感受并识别各种内外刺激信息[5]。PRRs可识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)，并向下游传递信号，引发一系列的免疫应答，从而对入侵的病原体或损伤等危险信号做出快速的反应，清除各种损害因素并修复机体损伤[6,7]。

根据PRRs存在的部位，可分为膜结合PRRs和胞内PRRs。膜结合PRRs主要包括Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLRs)；胞内PRRs主要包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NOD-like receptors，NLRs)和维A酸诱导基因Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)等。

TLRs是一类在天然免疫中起关键作用的膜结合PRRs。目前已发现并成功鉴定13种TLRs家族成员，不同的TLRs可以识别不同的病原刺激分子，TLR1～5主要位于细胞膜表面，可识别细菌及真菌成分，TLR3和TLR7～13则大多数位于内体或内体溶酶体，主要识别病毒及微生物核酸及内源性刺激分子[8]。当TLRs识别PAMPs/DAMPs后，可通过激活核因子kappaB (NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和c-jun N末端激酶(JNK)等信号通路，启动核转录和翻译功能，诱导产生各种促炎细胞因子及趋化因子而产生炎症[9]。研究证实，革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)与单核/巨噬细胞表面TLR4结合，通过修饰NF-κB、MAPK磷酸化水平而上调TNF-α、IL-8等细胞因子的表达，而抑制细胞NF-κB或MAPKs磷酸化水平可抑制细胞因子的释放[10]。近年来，大量体内及体外的研究也证实，抑制NF-κB或MAPKs等信号转导通路能够有效抑制炎症细胞因子的释放并减轻急性肺损伤[11-15]。

1.2细胞因子与IL-1家族 细胞因子是一类小分子蛋白质(分子量8～40 kD)，由免疫细胞、内皮细胞以及成纤维细胞等多种细胞产生，在细胞信号转导中起重要作用。其通过受体作用调节机体免疫应答，在介导感染、炎症、创伤、癌症和生殖的反应中起了重要的作用。细胞因子按其功能可分为促炎细胞因子及抗炎细胞因子。研究显示，适当分泌的细胞因子可通过旁分泌作用激活巨噬细胞或中性粒细胞产生局部抗炎作用，同时募集中性粒细胞到炎症部位并杀灭病原体[16]。然而，当细胞因子大量释放时，一方面激活内皮细胞，增加血管通透性使得免疫细胞渗出到炎症部位吞噬并杀灭病原体；但另一方面，也增加了毛细血管渗漏及血管扩张，导致了低血压等一系列有害的全身效应[4]。 在所有的细胞因子中，IL-1家族与天然免疫最密切相关，因为IL-1受体Ⅰ(IL-1RⅠ)的胞浆区与所有TLRs胞浆区都高度同源[17]。IL-1R与TLRs一起形成受体超家族，该家族的几乎所有成员的胞浆区均具有共同的功能域，也称之为Toll-IL-1R(TIR)结构域，因此，各种炎症刺激都可不加区分地同时激活TLR和IL-1R并激活下游信号通路，进而引发一系列炎症应答[18]。目前已发现10个IL-1家族成员，其中IL-1β因与自身免疫密切相关，故而也是IL-1家族中研究最多的成员之一。早期研究显示，重组IL-1β对中性粒细胞缺失小鼠抵抗致死性细菌感染具有重要的保护作用，提示恰当的细胞因子及炎症反应是保护机体并抵抗外源性刺激的屏障。但进一步研究发现，过度分泌的细胞因子，却常常成为各种急慢性炎症的病因。几乎所有的病原微生物均可通过TLRs诱导产生IL-1β，IL-1β以无活性的前体形式pro-IL-1β分泌并聚积在胞浆中，成熟IL-1β的生成是通过炎性体的活性成分caspase-1介导的，当炎性体被激活后，可募集并产生活性caspase-1，通过剪切作用产生活性IL-1β而进一步发挥生物学效应[19]。

1.3细胞因子风暴与急性肺损伤 感染、创伤、烧伤、大面积肺栓塞、大量输血和休克等多种病因均可引起ALI。但近年来大量研究表明，各种不同因素引发的全身炎症反应综合征是ALI发生的根本原因[1]。肺内外有害刺激可引发多种炎症细胞在肺内的募集和活化，释放大量细胞因子及趋化因子。其中，IL-1β与TNF-α在受到有害刺激早期即迅速分泌，数小时即达峰值，随后，机体开始分泌抗炎细胞因子调节炎症反应程度，使机体既能清除有害刺激，又能维持细胞稳态。但当有害刺激持久强烈或机体免疫亢进时，促炎抗炎平衡被打破，则这类“早期反应细胞因子”可进一步促进如IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、巨噬细胞炎症蛋白1α(Macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)、MIP-1β等一系列细胞因子及趋化因子的活化及释放，引起级联“瀑布效应”，从而形成一种失控的炎症反应，这一过程也被称为“细胞因子风暴”。

“细胞因子风暴”最早被用于描述移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)[20]，其本质是机体对于各种刺激所产生的一种过度免疫。细胞因子风暴与多种感染或非感染性疾病相关，甚至是不恰当治疗干预的结果[21]。近年来一些实验研究及临床研究中也发现，导致ALI的原因往往并非病原体本身，而是感染诱发了机体产生过度的免疫应答[22，23]。细胞因子风暴导致了广泛的肺上皮细胞和肺血管内皮细胞的损伤，最终引起ALI的病理改变，即肺血管通透性增高、肺水肿及透明膜的形成。由此提示，细胞因子风暴可能是ALI的根本发病原因[24]。

2 NLRP3炎性体与急性肺损伤

2.1NLRP3炎性体结构与功能 NLRP3炎症体是胞浆中的大分子蛋白质，属于NLRs家族,是一类胞内PRRs，在多种免疫细胞中广泛表达，是目前功能研究最明确的炎性体，主要包括NLRP3构架、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)以及caspase-1[25]。NLRP3构架主要包含3部分：中间的核苷酸寡聚化结构域(Nucleotide-binding and oligomerization,NACHT)，C末端的亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeats，LRR)，以及N端的效应结构域。当NLRP3识别PAMPs/DAMPs后，发生自身寡聚化使其效应结构域暴露形成一个“平台”，并募集衔接蛋白ASC。ASC包含2个结构域，胱天蛋白募集域(Caspase recruitment domain，CARD)和热蛋白结构域(Pyrin domain，PYD)。ASC被募集后，其PYD能和其他NLRs的同型PYD相互作用，通过CARD招募caspase-1的前体(pro-caspase-1)，并通过自身剪切作用形成成熟的caspase-1。ASC的两个结构域将NLRs与caspase-1联系在一起，使各种内源性或外源性刺激信号能够活化caspase-1[26]。而活化的caspase-1可以剪切pro-IL-1β形成成熟的IL-1β并分泌到胞外[27]。活化的IL-1β一方面可以诱导形成级联瀑布效应，引起炎症细胞因子风暴；另一方面可直接破坏肺泡上皮细胞，导致肺泡通透性增加而引发肺水肿。

2.2NLRP3炎性体与急性肺损伤 如前所述，失控的炎症反应而引发的炎症介质，在急性肺损伤的形成过程中起了关键作用[28]，IL-1β是关键的促炎细胞因子，其不仅导致炎症，更重要的是可以诱导一系列的促炎细胞因子及黏附分子的产生并加重肺部炎症[29]。Dolinay等[30]研究发现，脓毒症所致ALI患者血浆中caspase-1及IL-1β、IL-18表达增高，提示NLRP3炎性体激活，且IL-1β水平与患者病情严重程度、病死率呈正相关。研究显示，LPS刺激肺泡巨噬细胞不仅激活NLRP3炎症体并释放成熟的IL-1β，而且通过NF-κB依赖的信号途径上调巨噬细胞表面的IL-1RI的表达，从而导致肺泡巨噬细胞的焦亡(Pyroptosis)并加重肺部炎症[31]。同时，NLRP3炎性体可以活化肺泡巨噬细胞，加重肺损伤[32]。而抑制肺泡巨噬细胞的焦亡则可以有效减少LPS诱导的ALI[33]。上述研究显示，NLRP3炎性体通过调控细胞因子的水平，可能在ALI的形成过程中起了重要作用。

3 细胞自噬与急性肺损伤

细胞自噬(Autophagy)是真核生物进化中高度保守的、对细胞内物质进行周转的重要过程。自噬不仅能满足细胞自身代谢并维持细胞稳态，而且还是一种机体自身防御和应激调控机制[34]。当细胞处于感染、损伤等各种应激状况下，细胞自噬启动，降解受损、变性和失去功能的细胞器和蛋白质，实现细胞的再循环和再利用。细胞自噬参与调节多种重要的生理过程如细胞增殖、分化、炎症及免疫应答、程序性细胞死亡等[35]。近年来研究显示，细胞自噬与ALI的发生发展密切相关[36-38]。

3.1自噬调节炎性体活性 自噬与炎症体均有调节细胞代谢、维持细胞器正常功能、控制炎症及清除病原的作用，因此均有维持细胞稳态的效能[39]。Saitoh等[40]研究显示造血细胞自噬蛋白Atg16l1缺陷的小鼠，其IL-1β和IL-18水平上升，提示自噬可以起到调控炎性体活性的作用。Nakahira等[41]研究证实，自噬能清除进入细胞的病原体和机体中老化或受损的细胞器(如去极化的线粒体)，减少了胞内PAMPs/DAMPs积聚，从而间接抑制炎症体活性，而自噬缺陷小鼠由于炎性小体的活化导致血清IL-1β和IL-18水平明显增高。Pu等[42]研究显示，相比于野生型小鼠，Atg7基因敲除的脓毒症小鼠，因自噬功能受到抑制，NLRP3炎性体介导IL-1β释放增加，导致严重肺损伤引起死亡率增加。但自噬并非只有单纯抑制炎症的作用，如Dupont等[43]研究发现，自噬蛋白组分能促进成熟的IL-1β从胞浆分泌到细胞外而产生促炎作用，显示截然不同的效应。由此提示，自噬可能有利于机体调控促炎与抗炎的平衡，自噬与炎症体之间通过复杂的调控网络，共同维持细胞稳态[44]。

3.2自噬调节ALI 如前所述，细胞自噬是机体对有害刺激的保护性反应。研究显示，肺上皮细胞暴露于氯气1 h后出现线粒体功能受损并增加活性氧(ROS)的释放，而暴露6 h后细胞自噬功能上调并改善细胞功能[45]；动物实验发现类似效应，如高氧诱导的ALI小鼠模型中发现，其自噬标志物微管相关蛋白1轻链3B(Microtubule-associated protein 1 light chain3B-Ⅱ,LC3B-Ⅱ)及自噬体在胞浆内大量积聚，提示细胞自噬明显增强[46]。由此提示，ALI形成过程诱导并激活了细胞自噬水平。

那么，细胞自噬是否能调节ALI严重程度？Joosten等[47]研究显示，自噬可降解IL-1β前体pro-IL-1β，从而减少成熟IL-1β释放。Harris等[48]进一步证实，IL-1β的前体pro-IL-1β能特异性地被自噬体靶定并隔离，雷帕霉素能通过抑制雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)诱导细胞自噬，促进pro-IL-1β的降解而减少成熟的细胞因子释放。Tanaka等[46]研究显示，自噬相关蛋白LC3B基因敲除小鼠由于自噬缺陷而增加了高氧诱导的肺上皮细胞死亡。Lo等[49]研究还发现，在盲肠结扎穿孔法诱导的多细菌感染脓毒症小鼠模型中，自噬蛋白LC3过表达能增加细胞自噬功能，并有效地抑制小鼠ALI，增加小鼠存活率。最近，国内Jia等[50]研究显示，自噬诱导剂雷帕霉素可以通过抑制NLRP3炎性体，下调细胞因子IL-1β和IL-18的产生，并减轻LPS诱导的小鼠ALI。Zhao等[51]也发现，雷帕霉素诱导自噬明显减少了脓毒症小鼠血清中细胞因子的释放，改善ALI的严重程度并增加小鼠存活率。但Ding等[52]研究显示，自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)抑制自噬却反而抑制了肺部炎症，有效地逆转了LPS诱导的小鼠ALI，显示完全相反的结果。可见细胞自噬调节机体免疫功能是一个复杂的过程[53]。因此，尽管已经明确自噬参与了ALI的发生发展过程，但进一步明确自噬在不同病程或不同感染状态下的作用并进行靶向干预，对ALI的治疗有着重要的意义。

4 ALI的抗炎治疗

由于炎症及IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子在ALI早期起关键作用，使得抗细胞因子的治疗被引入临床，但多项随机双盲临床研究结果显示[54-56]，抗细胞因子治疗，如抗TNF-α单克隆抗体、重组抗IL-1受体拮抗剂(rhIL-1RA)等对脓毒症ALI患者的疗效总体上令人失望，其28 d死亡率并没有显著降低[55，56]。血浆IL-1受体拮抗蛋白(IL-1RA)属于IL-1细胞因子家族的成员，是IL-1β的天然抑制剂。最近一项回顾性研究发现，rhIL-1RA能够明显改善血浆IL-1RA高水平患者预后，使该组患者28 d死亡率降低约12%，提示血浆高表达IL-1RA可能对抗炎治疗具有更好的应答[57]，这意味着将来有必要对ALI患者进行更精确的个体化治疗。而近年来有证据表明，随着炎症反应的持续，大量免疫细胞凋亡耗竭，随后机体进入免疫抑制阶段[58]，故此阶段抗炎治疗可能反而对机体有害，而适当应用增强宿主免疫功能的免疫佐剂反而具有更积极的作用[59]。IL-7是一种多功能的细胞因子，其不仅可增加吞噬细胞的功能，还可诱导记忆性T细胞的有效增殖，有助于恢复脓毒症患者免疫抑制阶段T细胞的严重耗竭。最近完成的一项随机双盲的临床试验(IRIS-7研究，注册号NCT02640807)表明，经重组人IL-7(CYT107)治疗后患者绝对淋巴细胞计数、CD4+、CD8+T细胞计数增加了3～4倍并持续数周，显示积极的临床治疗前景[60]。

炎症信号转导通路在炎症反应中的关键作用同样受到关注，多项体内及体外实验研究证实,抑制NF-κB或MAPKs等信号转导通路能够有效抑制炎症细胞因子的释放[11-13,61,62]。乌司他丁是一种尿胰蛋白酶抑制药物，其能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减少细胞因子的释放，对LPS诱导的ALI动物模型有保护作用[63]。最近，我国启动了一项乌司他丁治疗脓毒症的多中心随机对照研究(ADJUST研究，注册号:NCT02647554)，其主要终点为患者28天的死亡率[64]。我们期待其抗炎效应能给脓毒症ALI患者带来一线曙光。而尽管多项体内及体外实验已经显示调节细胞自噬有利于减少细胞因子释放并减轻ALI，但目前相关药物尚未进入临床研究。

此外，高浓度氧疗和机械通气是目前临床上抢救ALI最基础的治疗手段。但近年来研究显示[65]，高氧可诱导小鼠肺内神经酰胺水平升高，进而激活NLRP3炎症体并诱导caspase-1的活化，导致IL-1β、TNF-α等细胞因子释放增加产生高氧性ALI。而NLRP3基因缺陷小鼠暴露于高氧环境时，其肺部细胞因子浓度及肺组织病理评分明显低于野生型小鼠[66]。提示针对NLRP3炎性体靶向治疗有望控制高氧性ALI。Wu等[67]研究显示，机械通气能激活小鼠肺泡巨噬细胞NLRP3炎性体的活性，增加成熟IL-1β释放，而中和IL-1β显著减少肺部炎症损伤，提示NLRP3炎性体参与了呼吸机相关肺损伤(Ventilation induced lung injury，VILI)的发生发展，不仅如此，VILI还与机械通气的模式密切相关，事实上，肺保护性通气已经成为目前急性呼吸窘迫综合征机械通气的目标[68]。可见，在临床救治ALI患者时，还需综合考虑氧疗浓度、时间及机械通气的模式对患者炎症及免疫反应的影响。

5 展望

ALI起病迅速，病情凶险，近年来，尽管越来越多的治疗方法用于抢救临床危重症患者，但针对ALI仍然缺乏有效的救治手段。而脓毒症相关的ALI仍然是ICU死亡率最高的临床综合征。正是由于ALI的发生发展，包括了炎症、免疫平衡及细胞自噬之间错综复杂的关系，因此也增加了疾病救治的难度，但进一步阐明炎症及自噬与ALI之间的关系，有可能成为一个新的治疗ALI靶点。同时，也亟待更多的实验和临床研究来进一步加以论证。