自噬抑制剂3-MA在神经系统疾病中的作用的研究进展

封秀梅，许明敏，黄 辰，李 瑛，张 微

(成都中医药大学针灸推拿学院，成都 610075)

自噬(autophagy)是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的细胞降解途径，是机体内存在的一种自我修复和维持生命的过程[1]。近年来，自噬作用正逐渐成为神经系统疾病研究中的热点，学者们发现自噬与神经系统疾病的发病机制密切相关[2-4]，而自噬抑制剂又被认为是探究疾病与自噬相关性以及开拓疾病新的治疗措施的关键点。1892年Seglen等[5]用饥饿Wistar大鼠分离的肝细胞筛选嘌呤相关物质，首次发现了3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可作为自噬抑制剂，自此以后3-MA被普遍应用于自噬的机制研究，在神经系统疾病的研究中应用尤为广泛。文章综述了3-MA在神经系统疾病自噬研究中的作用及其应用概况，以期为疾病的预防和临床治疗提供一定的参考和指导。

1 3-MA与中枢神经系统疾病

1.1 3-MA与脑缺血再灌注损伤

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury)是因各种原因造成脑组织缺血，经再灌注恢复供血后，机体损伤症状未得到改善反而加重的现象，是缺血性卒中主要的病理生理机制[6]。1995年Nitatori等[7]采用透射电子显微镜首次发现了脑缺血后神经细胞中存在自噬现象。近年来学者们也从生物化学和形态学等方面，先后证实了在脑缺血不同阶段皆存在自噬激活现象，但3-MA在脑缺血中的确切作用一直存在着很大争议。Puyal等[8]发现缺血区的微管相关蛋白LC3-II在缺血再灌注早期的数小时内开始升高，而使用3-MA则可显著下调LC3-II的表达，同时减轻脑损伤，减小脑梗死病变区域。Wang等[9]于脑缺血再灌注后2 h经侧脑室分别注射促黑激素(intermedin，IMD)和3-MA进行治疗，24 h后发现IMD组和3-MA组自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I表达均较模型组明显降低，提示IMD与3-MA具有相似的作用，均可改善病理性神经元损伤。Wen等[10]也揭示了3-MA可显著减小脑梗死体积，降低脑水肿及运动缺失表现。相反地，Carloni等[11]发现脑缺血后皮质及海马区的Beclin-1在短时间内显著上调，且只在发生缺血缺氧损伤的神经元中表达，应用3-MA可加重脑损伤，明显增多坏死细胞数量，提示3-MA在缺血缺氧早期对神经元具有损伤作用。Sheng等[12]同样证实了3-MA可有效阻断自噬的活性，降低缺血预处理对缺血再灌注损伤脑组织的保护作用，加剧神经细胞的坏死。

关于3-MA在脑缺血再灌注损伤中呈现出如此不同的作用，初步猜测主要是因为在脑缺血的不同阶段自噬被激活的程度不一致。Shi等[13]在实验中观察到了3-MA在复氧不同阶段的双重作用，在24 h前再灌注，3-MA引发神经元死亡率高，而48～72 h再灌注，3-MA具有明显保护神经元的作用，延长再灌注会引发过度的自噬，3-MA的作用也发生相应转变。Zhang等[14]发现造模方式会影响3-MA的作用，在永久性脑缺血模型小鼠中，通过3-MA预处理可减小梗死面积，而在短暂性脑缺血模型小鼠中，再灌注开始后立即进行3-MA治疗反而增加了梗死面积。此外，缺血程度、缺血区域、3-MA注射时间和注射周期、实验动物及实验环境等也可能是相关影响因素。因此，3-MA在脑缺血再灌注损伤中是加重还是减轻脑损伤不可一概而论，需考虑诸多可能的影响因素，进一步深入研究，若能正确引导自噬使其适时地在脑缺血的防治中发挥积极作用，这将为其治疗开启新纪元。

1.2 3-MA与脊髓损伤

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的创伤性疾病，可导致神经功能缺损和运动功能障碍[15]。越来越多的研究发现3-MA在脊髓损伤中的作用值得深究。Zhang等[16]为研究自噬在脊髓损伤中的作用以及锂的神经保护作用，在脊髓损伤6 h后对锂组大鼠腹腔注射1 ml锂(30 mg/kg)，而3-MA组在注射锂的同时还于损伤前2 h腹腔注射1 mL 3-MA(3 mg/kg)，结果发现锂能促进神经功能恢复和神经细胞存活，而3-MA下调了锂诱导的自噬，抑制了其产生的神经保护作用。Li等[17]也在实验中发现，于造模前20 min采用3-MA干预，能降低Beclin-1的表达，且抵消了雷帕霉素(rapamycin)产生的神经保护作用，加剧了神经元胞体的凋亡。相反地，有研究者[18]在实验中自第十胸椎脊髓背侧缓慢注射3-MA(200 nmol/L)，然后进行造模，结果发现3-MA对大鼠脊髓损伤具有保护作用。Lei等[19]的研究结果也支持3-MA在脊髓损伤中的积极作用。

Zhang等[16]与杨德刚等[18]的实验中3-MA发挥着相反的作用，注射部位可能是关键，尚待验证。在脊髓损伤后，自噬的水平将明显上升，神经元的自噬水平与脊髓神经功能的恢复密切相关，正如Hou等[20]的实验结果。Fang等[21]亦发现在脊髓缺血再灌注早期3-MA加重了再灌注产生的损伤，而在损伤72 h后，3-MA则减少了神经元的丢失，具有保护神经元的作用。也有研究[22]间接证明3-MA在体外可通过调节炎症反应来调控脊髓损伤的修复进程。因此，深入了解3-MA在脊髓损伤中的作用机制，对神经损伤的恢复具有重要的临床指导意义。

1.3 3-MA与帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以多巴胺能(dopaminergic，DA)神经元的进行性、广泛性丢失及其胞内不溶性α突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)形成路易小体聚集为标志的中枢神经退行性疾病[23]。研究发现细胞自噬功能障碍可致α-Syn清除受损，而α-Syn的增多又可造成自噬功能受损，最终导致蛋白质异常聚集、线粒体功能障碍及神经细胞毒性等[24-25]。此外，包括PARK7基因[26]、PINK1基因[27]、PARK8基因[28]等与PD相关的基因都在一定程度上参与了自噬的过程，而近年来对此病的干预也主要集中在对其自噬水平的调节研究上。Jin等[29]在实验中同时应用雷帕霉素和3-MA，结果显示3-MA可增强肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)激发的小胶质细胞的神经毒性作用，造成更多DA神经元的丢失。Han等[30]在培养基中加入5 mM 3-MA，发现PLIN4沉默导致的神经保护被3-MA抑制。然而，有研究者[31]使用自噬抑制剂3-MA证实肉桂醛在PD模型中具有神经保护作用，提示抑制自噬可能是今后治疗PD的新方向。

从当前的证据来看，3-MA在PD中发挥着双重作用，一方面，3-MA阻碍自噬清除错误折叠的蛋白，从而导致PD的发生，而另一方面，3-MA可抑制过度激活的自噬，延缓PD的发展甚至避免PD的发生，再次验证了自噬是一个动态变化的过程，不足或过度的自噬水平对神经细胞的损伤修复都是不利的。因此，进一步研究3-MA在PD中的调节机制，探讨药物治疗的起效途径，可为其治疗提供新策略。

1.4 3-MA与其他中枢神经系统疾病

3-MA在其他中枢神经系统疾病中也有运用，如蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)、创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)及阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)等。Guo等[32]经脑室注射3-MA，发现3-MA可抑制白藜芦醇激活的自噬，减缓神经功能的恢复。有研究[33]表明在小鼠TBI模型中，3-MA经侧脑室预给药后，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平明显降低，减少了神经细胞死亡，减小了脑损伤面积，并能改善运动功能障碍，加速学习与记忆能力的恢复。有学者[34]发现电针能有效降低神经元凋亡，改善AD大鼠学习记忆能力，而在针刺前30 min经腹腔注射3-MA(0.5 mg/kg)后针刺的治疗效应被阻断。此外，在血管性痴呆[35]及癫痫[36]模型中，3-MA也被证实有助于神经的损伤修复。

2 3-MA与周围神经系统疾病

周围神经损伤后，神经轴突出现脱髓鞘病变、断裂变性和神经水肿等，损害的远端出现瓦勒氏变性等一系列的病理性改变[37]，而自噬能清除雪旺细胞内崩溃的髓鞘碎片和受损细胞器，促进损伤神经的修复[38]。Lu等[39]研究发现，大鼠再生的坐骨神经主要通过细胞自噬来维持正常形态，而[40]3-MA恰恰通过抑制自噬起相反的作用，使轴突和髓鞘再生受到抑制。还有学者[41]通过结扎坐骨神经建立神经性疼痛模型，于术后1 h经腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，证实了3-MA能抑制自噬，明显恶化神经病变状况。相同的，Chen等[42]也证实了周围神经损伤激活了自噬，自噬参与了损伤的周围神经的更新和再生，使用3-MA则阻碍神经的再生。

可见，在周围神经系统疾病中3-MA不利于神经修复及再生。但目前3-MA在周围神经系统疾病中的研究局限于坐骨神经损伤，尚缺乏对其他病种的研究。故笔者通过文献研究认为，扩展病种，探索自噬在周围神经损伤修复及再生中的具体作用及其可能机制具有重要的价值，这或许是今后研究的突破点。

3 3-MA在神经系统疾病中的使用

3-MA的注射频次有单次注射[18]和多次注射[34,41]，可于造模前[16,35]或造模后[18,36]注射，主要根据实验的目的灵活选择。由于3-MA作为自噬抑制剂对Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的作用是短暂的[43]，而自噬又是一个动态变化的过程，故若想观察疾病不同时间点的自噬水平，最好每日注射。3-MA在实验中常选择的注射部位为腹腔[16-17]或脑室[11,32]，也可经尾静脉[44]或者脊髓注射[18]。不同部位的起效方式不同，腹腔注射主要通过体液循环最终作用于病所，可调整全身的自噬水平，但靶向性不强；而脑室注射直接作用于特定脑区，针对性强，但对动物的损伤较大，死亡率较高。在今后的研究中我们可多加论证其他部位注射的可行性，并进一步摸索其起效量及产生的一系列副作用。3-MA在培养基中常选用的浓度为5 mmol/L[5,30]，活体实验中的使用浓度范围在0.5～30 mg/kg[16,34,41]，这主要跟注射频次及注射部位存在一定相关性。对于其配制方法，目前多用二甲基亚砜(dimethyl sulfone，DMSO)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、生理盐水等溶解，也可以先用DMSO配制后再用PBS缓冲液缓冲至所需浓度。

4 3-MA作为自噬抑制剂的优缺点

3-MA作为自噬抑制剂，其优势为对细胞的损害较小，且能够特异性地抑制PI3K。PI3K是自噬激活的必要条件[45]，其主要有3种类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PI3K。研究已证实了3-MA主要抑制Ⅲ型PI3K[46]，通过抑制Beclin-1-PtdIns 3KC3 复合物的形成来抑制胞浆可溶性形式LC3-I向自噬体膜结合形式LC3-Ⅱ转化。最近的研究[43]表明3-MA在培养基中具有双重作用，在营养缺乏培养基中抑制自噬，而在营养丰富的条件经过长时间的治疗可促进自噬。关于3-MA促进自噬的研究目前较少，Wu等[43]证实了3-MA能持续阻断Ⅰ型PI3K，其可能是通过抑制Ⅰ型PI3K下游的信号分子蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)在Thr308和Ser473处的磷酸化来激活自噬[47]，有待验证。此外，3-MA在室温下溶解性差，一般在使用前需在60℃～70℃的水浴中加热促溶[48]，且仅在高浓度下有效。所以，开发可溶性高、特异性强的自噬抑制剂对神经系统疾病的研究是至关重要的。有研究[49]通过化学修饰3-MA，合成得到了三个3-MA的衍生物，它们表现出更高的可溶性和更强的特异性，且仅抑制Ⅲ型PI3K而不抑制Ⅰ型PI3K，不足的是对细胞存在一定毒性作用，可见利用化学修饰可能是优化3-MA性能的一种行之有效的方法。

自噬的机制十分复杂，3-MA不能完全抑制所有的自噬途径，还有许多不受3-MA调控的信号通路。单纯自噬体的减少不能准确判定自噬被抑制，有可能是自噬体与溶酶体的融合受阻，所以还需结合使用自噬体与溶酶体融合的抑制剂氯喹、巴佛洛霉素A1或敲除溶酶体关联膜蛋白2来观察自噬流的变化，进一步评判是否成功抑制自噬，以得到可靠的实验结果。有研究显示[5]5 mmol/L 3-MA对于自身自噬的阻断可达到60%。然而，在研究电针对自噬水平影响的实验中，3-MA似乎完全抵消了针刺的保护效应[35]，最可能的解释是3-MA可抑制通过针刺预处理诱导的大部分自噬。郭科等[36]在造模后固定于每日上午8点注射3-MA，故3-MA的起效机制是否受昼夜节律影响有待验证。

5 结语

综上，自噬抑制剂3-MA被多方证实参与了神经细胞的损伤修复及再生过程，与大部分神经系统疾病的关系也已被广泛研究并迅速成为神经科学领域的研究热点，但在其中的具体作用受诸多因素影响。此外，缺乏高效的自噬抑制剂依旧是理解自噬在神经系统疾病中的生理病理作用的障碍所在，3-MA作为相对成熟的自噬抑制剂，在神经系统疾病研究中应用较为灵活，但仍存在诸多不足之处。因此，探索3-MA的更多特性，明确其在疾病不同状态下的作用是当下需重点突破的难题，也将是今后神经系统疾病研究的关键所在。