循环微小RNA-1 诊疗心肌梗死的研究进展

苏彤、张晓璞、李勋综述，杨承健审校

我国心血管病患病率处于持续上升阶段，心血管死亡率高居首位。其中心肌梗死发病急而凶险，病死率高，2002～2015 年急性心肌梗死死亡率总体呈上升态势，早期诊疗对改善预后十分重要[1-2]。近年来研究了各种早期诊断心肌梗死新的生物学标志物以及治疗靶点，其中包括非编码RNAs（NcRNAs），即一类高度保守，通常情况下不编码蛋白质但在功能上调节蛋白质表达的RNA 分子[3]。目前推测这些非编码转录物是生理和病理条件下基因表达的关键调控者，根据转录物长度将NcRNAs 分为短链、中链、长链以及环状RNAs，其中被广泛研究的、与心肌梗死相关的NcRNAs 是microRNAs（miRNAs，miRs）。

miRs 是一类调控基因表达、高度保守的非编码短链RNA（21～24 nt），参与多种信号通路的调节，维持机体内环境稳态，并且在健康者和各种疾病患者表达谱存在明显差异，同时稳定存在于外周血中，具备诊疗心肌梗死的潜力[4]。miR-1 存在心肌细胞表达特异性，是首个发现与心血管发展相关的miRs。miR-1 家族包括miR-1 亚家族和miR-206，miR-1 亚家族包括了miR-1-1 和miR-1-2 两个转录本。在人类，这两个转录本的成熟产物相同，具有共同序列，但其基因分别定位于2 号染色体和18 号染色体，故miR-1 亚家族表达于心肌和骨骼肌细胞，而miR-206 只表达于骨骼肌细胞。近年来，多项研究提示miR-1 直接参与调控了心肌梗死的整个病理过程，通过检测miR-1 的表达量变化以及上游调节有助于改善心肌梗死预后[5-7]。

1 诊断心肌梗死

目前，临床上诊断心肌梗死主要依靠患者临床表现以及心电图（ECG）动态改变，当二者出现诊断困难时，需联合以肌钙蛋白（cTn）为代表的生物学标志物，目前cTn 仍是诊断心肌梗死的“金标准”，但cTn 一般在心肌梗死发病3 h 左右才开始升高，24 h 左右达到峰值，并且在发生主动脉夹层、肾功能衰竭终末期、肺栓塞、急性心力衰竭时同样升高，此时若存在冠状动脉造影禁忌证或患者及家属拒绝有创诊疗方式，诊治将会非常棘手[8-10]。因此，有必要寻找新的诊断心肌梗死的生物学标志物。优秀的标志物应当满足以下条件：获取方法较易，如血液和尿液；具备心脏特异性；正常情况下，在循环系统中的表达水平很低或检测不到，并且表达水平应与心肌梗死严重程度相关；如果心肌梗死发生，标志物应该在很短的时间内从损伤的心肌释放到血液循环中，并具有相对较长的半衰期便于检测。

早期动物研究提示，在大鼠冠状动脉结扎1 h后即能检测到血浆中miR-1 明显增加，6～12 h 达峰值，24 h 明显下降，这为早期诊断心肌梗死提供了新思路[11]。Qipshidze Kelm 等[12]通过结扎不同年龄小鼠冠状动脉前降支制作心肌梗死动物模型，通过实时定量反转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测血浆中miR-1 以及miR-133a 含量，研究提示miR-1升高更为明显，并且年龄较大的小鼠心肌梗死后血浆中miR-1 的含量增加且与心功能减退正相关。

近年来，有关miR-1 早期诊断心肌梗死的临床研究结果也较多，已有相关系统评价荟萃分析发表。李春雨等[13]对2010 年1 月1 日至2015 年11 月20日发表的中国患者miRs 诊断心肌梗死的24 项研究3 066 例受试者进行了分析。其中主要涉及miR-1、miR-499、miR-208 和miR-133，8篇研究报道了miR-1，采用灵敏度（Sen）、特异度（Spe）、诊断优势比（DOR）、ROC 曲线下面积（AUC）作为评价指标，各研究之间异质性明显（P＜0.10，I2=74.8%），合并Sen、Spe、DOR 以 及AUC 分别为0.73（95%CI：0.69～0.78）、0.84（95%CI：0.80～0.87）、24.74（95%CI：9.17～66.77）和0.8374，若miR-1 联 合miR-133、miR-499 诊断心肌梗死，诊断效能不俗。

在另一项对亚洲心肌梗死患者展开的系统评价中，检索了2017 年2 月公开发表的miRs 诊断心肌梗死的文献，共纳入26 项研究，包括1 973 例心肌梗死患者，1 236 例健康对照组，其中9 项研究涉及miR-1，分析所有涉及miR-1 的研究，提示各研究之间异质性明显（P＜0.10，I2＞50%），合并Sen、Spe、DOR 以及AUC 分别为0.70（95%CI：0.66～0.74，P＜0.05）、0.81（95%CI：0.78～0.85，P＜0.001）、15.20（95%CI：7.48～30.89，P＜0.001）和0.8409，此外，通过Deeks 检验评估miR-1 的发表偏倚，结果表明发表偏倚可能性较低，同时比较研究较多的miRs，提示miR-499 诊断效能较高[14]。

我们的研究通过收集急性胸痛患者发病3 h 内血浆，根据诊断结果分为心肌梗死组与非心肌梗死组，同时纳入同期体检患者作为对照组，通过qRT-PCR 检测miR-1 含量，并与cTn、肌酸激酶同工酶（CK-MB）比较，发现心肌梗死组血浆miR-1、cTnI、CK-MB 较非心肌梗死组和对照组升高（P均＜0.001）；心肌梗死患者血浆miR-1 与cTn、CK-MB均呈显著正相关（P均＜0.001）；miR-1 的AUC 为0.905（P＜0.001），cTn 的AUC 为0.908（P＜0.001），CK-MB 的AUC 为0.795（P＜0.001），结果提示血浆miR-1 可早期诊断心肌梗死，诊断效能优于CKMB，且与cTn 相当，并且可以提供cTn 以外的诊断信息，二者联合应用可能有助于提高心肌梗死早期诊断的准确性[15]。

2 治疗心肌梗死

心肌梗死可导细胞缺氧，同时激活内皮细胞、升高活性氧水平、产生炎性趋化因子及细胞因子，致使炎症细胞聚集在梗死区域、损伤心肌，同时激活病理性信号通路导致氧化剂及蛋白水解酶释放，促使心肌细胞死亡、内皮毛细血管损伤及扩大梗死范围，最后导致心脏重构、心肌纤维化等不良结局[16-17]。发病黄金时间的再灌注治疗目前仍然是首选方案，Varga 等[18]首次证明大鼠血浆miRs表达谱受到缺血再灌注诱导的显著影响，这表明miRs 参与心脏保护性信号传导，提示特定的保护性miRs 可作为用于治疗缺血再灌注损伤的潜在治疗工具。已有研究发现miR-1 存在特定的基因调节功能，参与干细胞修复心肌梗死后心肌损伤，是干细胞分化的调节器，可以提高移植细胞的存活率，从而提供新的治疗靶点[19-21]。

Huang 等[22]通过将丰富表达的miR-1 骨髓间充质干细胞（BMSCs）注入心肌梗死部位，可以提高 BMSCs 生存时间，其机制可能是miR-1 可抑制notch 下游靶基因Hes-1 而促进干细胞分化成心肌细胞，从而提高心肌梗死的心肌修复和改善心功能，此研究表明miR-1 可能通过调节靶基因改善干细胞治疗心肌梗死效果。与此同时，相关研究表明miRs可增加心脏祖细胞（CPCs）增殖，其中miR-1 可在血管生成分化中上调，抑制Spred1 蛋白，控制生长因子激活，从而对血管生成出现负反馈作用，促使人类心脏祖细胞（hCMPCs）对这些血管生长因子敏感，分化形成新的血管，该研究同时经过迁移实验证实了miR-1 能增加hCMPCs 的能动性[23]。

Izarra 等[24]证实了miR-1 可以抑制基因BIM、BMF 表达，从而抑制心肌细胞凋亡，同时促进CPCs分化。先前有研究证实miR-1 能促进胚胎干细胞（ESCs）向心肌样细胞分化，通过将转染miR-1 的ESCs 移植至心肌梗死部位，结果发现优于仅将ESCs植入心肌细胞，提示miR-1可改善心肌梗死后心功能，因过表达的miR-1 可激活p-Akt 并且抑制Caspase-3、PTEM 以及超氧化物产物从而抑制心肌细胞凋亡，抵抗氧化应激，减少心肌损伤[25]。

针对心肌梗死的早期治疗以及预防并发症极为关键，心肌梗死发病早期的死亡原因主要是室性心律失常。研究发现，细胞内运输系统的失调在心血管疾病的发展中起着重要的作用，心肌梗死小鼠模型血浆中miR-1 含量明显升高，促使与细胞内运输相关的基因Stx6、Braf、Ube3a、Mapk8ip3、Ap1s1、Ccz1、Gja1 下调，进一步研究发现心肌梗死后小鼠心脏中和缺氧心肌细胞中Stx6 降低，进一步证实Stx6 是miR-1 的靶标；相反，Stx6 的过表达减弱了miR-1 或缺氧对PLM 和L 型钙通道的损伤，表明miR-1 通过调节Stx6 参与心肌梗死后缺血性心律失常的发生，这为miR-1 通过调节运输相关基因的途径参与心肌梗死后心律失常提供了新的见解[26]。

已有研究证实缝隙连接蛋白43（Cx43）主要构成心室肌细胞的心肌缝隙连接通道，其表达下降可减慢电传导，延长复极，减慢传导速率，导致病理性折返回路，出现各种恶性室性心律失常，尤其是缺血性心律失常，而研究证实下调miR-1 表达，调节其靶基因GJA1、KCNJ2，上调Cx43 和Kir2.1 蛋白表达，恢复去极化的静止膜电位，从而治疗快速型心律失常，特别是通过将miR-1 特异性反义寡聚核苷酸（AMO-1）导入缺血心肌后效果显著[27-30]。Xue等[31]通过以树突细胞为基础的纳米载体传递miR-1抑制剂来早期靶向治疗小鼠心肌梗死，在小鼠心肌梗死发生后黄金救治时间内对梗死部位进行治疗，研究发现血管紧张素受体的亚型（AT1）在心肌梗死后24 h 内表达最明显，并且开发了一种以AT1 靶向肽为靶点的纳米载体（AT1-PEG-DGL），将其与AMO-1 相结合；静脉给药后的成像表明AT1-PEG-DGL 早期迅速积累在心肌梗死心脏中，显著优于没有AT1 靶向的对照组；最重要的是，在单次静脉注射后发现效果显著的抗心肌细胞凋亡作用，心肌梗死边缘区的凋亡细胞显著减少，梗死面积比对照组减少64.1%，提示有希望用于早期心肌梗死治疗。

先前有研究显示可溶性环氧化物水解酶抑制剂（sEHIs）能够产生对缺血诱导的致死性心律失常的心脏保护作用[32-33]。Gui 等[34]通过结扎冠状动脉建立小鼠心肌梗死模型，观察到新型sEHIs t-AUCB通过抑制miR-1 的过表达，促使KCNJ2/ Kir 2.1 和GJA1/Cx43 mRNA/蛋白质的上调，进一步研究结果表明PI3K/Akt 信号通路可能参与了sEHIs 对miR-1的负调控，从而降低心肌梗死小鼠的梗死面积和诱导性心律失常的发生率。

传统医学也有相关研究，Wu 等[35]研究发现，稳心颗粒通过调节miR-1 和PKC 介导的信号传导来保护缝隙连接及其组成部分Cx43 的超微结构，并且在大鼠心肌梗死模型中显著增加心室颤动阈值，从而降低梗死后缺血性致死性心律失常的发生率。

3 展望

目前，miRs 用于心肌梗死早期诊断的研究结果不一，由于不同miRs 诊断价值不同，需要2 或3 种miRs 的组合才能优于目前的金标准cTn，致使成本相应增加，临床应用仍然需要大规模、多中心的研究来进一步明确最有诊断价值的miR，同时加快对其稳定性、跨膜性、特异性、安全性、成药性以及如何才能建立满足临床需要的检测方法等研究，并且可以进一步细化其诊断特异性，才能使其尽早安全有效地应用于临床，例如Li 等[36]进一步研究具备诊断冠状动脉粥样硬化斑块破裂的标志物miRs，具有较好前景，可填补目前这方面生物学标志物的空白。从治疗方面看，目前大多数研究基于基础研究，临床的心肌梗死模型多为永久性损伤模型，没有考虑到再灌注治疗对其效果影响，这需要逐步结合临床，采用能反映临床实际的缺血再灌注模型来研究，同时找出更合适的miRs 载体，寻求更可靠的靶向治疗策略，以及给药方式和给药时机的把握，这些都需要进一步研究。