西黄丸对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭及STAT3信号通路的影响

朱正春，姚梦群，严芳莉，仲 飞,，3

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均逐年上升，严重威胁人类的生命健康。早期肝癌患者的治疗仍以手术为最佳治疗手段，但绝大多数患者在确诊时已失去了手术的机会，多依赖于化学药物的治疗，然而，化疗对肝癌患者具有较大的副作用，因此开发新型的抗肿瘤药物对于临床具有积极的意义[1-2]。西黄丸由牛黄、麝香、乳香及没药组成，具有消肿止痛、解毒散痈、软坚散结之效，是临床上治疗“肺痈”、“痰核”、“瘰疬”及“乳岩”之名方。据报道，异常激活的STAT3信号通路与多种肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等均密切相关[3-5]。该研究将考察西黄丸对肝癌细胞的增殖、侵袭及STAT3异常激活的抑制效果。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器西黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批准文号：国药准字Z11020073，规格：3 g/瓶)；人肝癌细胞株HepG2(美国ATCC公司)；细胞培养箱(型号：Forma 370，美国Thermo公司)；MTT试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM培养液、胎牛血清及胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；倒置相差显微镜(日本尼康公司)；鼠抗人STAT3及p-STAT3单克隆抗体及GAPDH内参(美国Sigma公司)；Transwell小室(美国Millipore公司);PCR仪(型号：MyCycler)、蛋白电泳仪及转移仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1分组 采用相同的人肝癌细胞株HepG2作为研究对象，依据外源性给予的西黄丸含药血清浓度不同分为西黄丸低剂量组(4 mg/ml)、西黄丸中剂量组(8 mg/ml)及西黄丸高剂量组(16 mg/ml)。

1.2.2西黄丸含药血清的制备 首先利用研钵将西黄丸研磨呈细粉，并以预冷的DMEM培养基浸泡于密闭的容器内48 h(生药量为100 mg/ml)，超声震荡2 h助溶，然后提取上清液，过滤膜(0.22 μm)，然后调整至所需浓度[6]。

1.2.3细胞培养 人肝癌细胞株HepG2用含有10%的胎牛血清的DMEM培养基内培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养，2～3 d传代1次，待细胞处于对数生长期时进行实验。

1.2.4MTT检测西黄丸对肝癌细胞的增殖作用 以1×105个/ml的密度将HepG2细胞株接种于96孔培养板中，对照组加入100 μl的DMEM培养基，药物组设置3个浓度，分别是西黄丸低剂量组(4 mg/ml)、西黄丸中剂量组(8 mg/ml)及西黄丸高剂量组(16 mg/ml)，每个组别设置3个复孔，分别作用24、48、72 h，避光加入终浓度为0.5 mg/ml的MTT溶液100 μl，37 ℃培养4 h，弃掉上清液，加入DMSO 150 μl，摇床震荡10 s，使用酶标仪于490 nm处测定各酶标孔的吸光度值，并计算抑制率，重复3次实验。抑制率(%)=(1-OD实验组/OD对照组)×100%。

1.2.5Transwell小室检测 将HepG2肝癌细胞接种于Transwell小室内，加入不同浓度的西黄丸，于下室内加入培养基，孵育48 h，固定细胞，进行DAPI染色。

1.2.6RT-PCR RT-PCR法测定基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)mRNA和MMP-9 mRNA的表达，各组作用细胞48 h后，采用TRIzol法提取总RNA，反转录按照Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行，以GAPDH作为内参，扩增后，以2-ΔΔCt方法计算MMP-2和MMP-9 mRNA的表达。RT-PCR引物序列：MMP-2：上游引物：5′-GGCACCCATTTACACCTACA-3′，下游引物：5′-CCAAGGTCAATGTCAGGAGAG-3′；MMP-9：上游引物：5′-GAACTTTGACAGCGACAAGAAG-3′，下游引物：5′-CGGCACTGAGGAATGATCTAA-3′；GAPDH：上游引物：5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3′，下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′。

1.2.7Western blot 各剂量的西黄丸作用于肝癌细胞48 h，裂解细胞，提取蛋白，然后加入到SDS-PAGE蛋白凝胶上样孔内，120 V电泳30 min，之后将蛋白质转移至PVDF膜，分别加入一抗p-STAT3(1 ∶500)、STAT3(1 ∶500)，4 ℃摇床过夜，加入二抗(1 ∶5 000)，室温孵育1 h，曝光，以目的蛋白的条带与对应内参GAPDH条带的灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1西黄丸对肝癌细胞增殖作用的抑制率与作用24 h比较，作用48 h及72 h的相同浓度西黄丸对肝癌细胞的抑制作用显著增强，呈时间依赖性(P<0.05)，与西黄丸低剂量组比较，西黄丸中及高剂量组肝癌细胞的抑制作用显著增强，呈剂量依赖性(P<0.05)，见表1。

表1 西黄丸对肝癌细胞增殖作用的抑制率

与西黄丸低剂量组比较：*P<0.05；与24 h作用时间比较：#P<0.05

2.2不同浓度的西黄丸对肝癌细胞侵袭作用的影响与对照组比较，西黄丸低、中及高剂量组肝癌细胞的侵袭作用均显著减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 不同浓度的西黄丸对肝癌细胞侵袭作用的影响

1：对照组；2：西黄丸低剂量组；3：西黄丸中剂量组；4：西黄丸高剂量组；与对照组比较：*P<0.05

2.3不同浓度的西黄丸对肝癌细胞侵袭作用的影响

2.3.1不同浓度的西黄丸对肝癌细胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达的影响 与对照组比较，西黄丸低、中、高剂量组的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达均显著降低(P<0.05)；与西黄丸低剂量组比较，中、高剂量组的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达均显著降低(P<0.05)；与西黄丸中剂量组比较，高剂量组的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达均显著降低(P<0.05)。见表2。具体扩增曲线见图2。

表2 不同浓度的西黄丸对肝癌细胞MMP-2和MMP-9 mRNA表达的影响

与对照组比较：*P<0.05；与西黄丸低剂量组比较：#P<0.05；与西黄丸中剂量组比较：△P<0.05

图2 MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的RT-PCR扩增曲线

A：MMP-2 mRNA的RT-PCR扩增曲线； B：MMP-9 mRNA的RT-PCR扩增曲线

2.3.2不同浓度的西黄丸对肝癌细胞STAT3及p-STAT3蛋白表达的影响 与对照组比较，西黄丸低、中、高剂量组的p-STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与西黄丸低剂量组比较，西黄丸高剂量组的p-STAT3蛋白表达显著降低，见表3。3个剂量组的Western blot条带见图3。

表3 不同浓度的西黄丸对肝癌细胞STAT3及p-STAT3蛋白表达的影响

与对照组比较：*P<0.05；与西黄丸低剂量组比较：#P<0.05

图3 Western blot法检测西黄丸对人肝癌细胞株HepG2中p-STAT3及STAT的影响

3 讨论

原发性肝癌是人类常见的恶性肿瘤之一，恶性程度较高，肝脏移植和外科手术切除是目前临床上的主要治疗手段，肝癌的临床转移率较高，侵袭和转移是肝癌的显著特征，同时也是肝癌患者预后较差的重要原因之一，因此找寻出肝癌细胞侵袭转移的调控和分子机制对于指导临床具有积极的科学意义。西黄丸始载于《外科证治全生集》，为清代名医王洪绪所创，原称为犀黄丸，由牛黄、麝香、乳香及没药组成，方中牛黄性凉、味甘、苦，具有化痰利胆、清热解毒之效；麝香性温、性温、味辛，具有消肿散结之效；乳香没药相须为用，具有消肿止痛、行气活血之效。诸药合用，既可消肿散坚、活血祛瘀，又可解毒散结、益气扶正，以达到去邪而不伤正的治疗癌症的目的。现代药理研究[7-8]表明，西黄丸对乳腺癌、结肠癌、卵巢癌细胞均有一定的抑制作用，同时还可缓解化疗药物产生的副作用。增殖和侵袭是肝癌细胞的基本特点，本研究MTT结果显示，西黄丸对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，呈时间和剂量依赖性(P<0.05)，同时Transwell侵袭实验也得出，与对照组比较，西黄丸低、中及高剂量组肝癌细胞的侵袭作用均显著减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示西黄丸可缓解肝癌细胞的异常增殖及侵袭作用。STAT3为STATs家族的重要成员之一，定位于人体第12号染色体上，是细胞内重要的信号传递和基因表达的调控因子，其下游的靶基因主要参与调控细胞的增殖、分化、转移等。正常情况下，未活化的STAT3存在于细胞质中，而在肿瘤细胞内，由于某些细胞因子或者生长因子的失调，将会导致STAT3异常激活并且长时间的处于高表达状态，促进肿瘤细胞的增殖并抑制其凋亡[9-10]。基质金属蛋白酶是一种锌离子依赖性的内肽酶，可降解细胞外基质和细胞基底膜的蛋白水解酶，既往研究[11-13]显示，MMP-2和MMP-9均是STAT3调控细胞增殖和侵袭的靶基因，在肿瘤细胞内，基质的异常降解可诱发肿瘤细胞的生长失去控制，进而导致炎症的产生、重塑及浸润转移，故而MMP在肿瘤细胞的侵袭转移中发挥重要的作用，肿瘤细胞转移的重要环节即是STAT3与MMP细胞外基质及基底膜的破坏与降解[11-13]。本研究RT-PCR结果显示，与对照组比较，西黄丸低、中、高剂量组的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达均显著降低(P<0.05)，蛋白水平上也证实，与对照组比较，西黄丸低、中、高剂量组的p-STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05)，提示西黄丸可通过下调p-STAT3蛋白表达来发挥抗肝癌的作用。

综上所述，西黄丸可显著抑制HepG2肝癌细胞的增殖及侵袭作用，机制可能与抑制STAT3异常激活有关。