粳稻02428突变体RIL孕穗期耐冷性状与糙米功能成分的遗传分析

谢勇武，曾亚文，谭属琼

（1.福建师范大学 闽南科技学院，福建 泉州 362332；2.云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所）

黄酮、γ-氨基丁酸（GABA）及抗性淀粉（RS）是重要的次生代谢物质。稻米黄酮类化合物中研究较多的花色苷类物质，具有抗癌、益智、抗氧化、降低血清胆固醇和血清脂质等功效；GABA是谷氨酸脱羧酶转化的产物，在人体代谢中起着重要作用；RS具有热量低及功能多等特点，常常作为食品的基料，可有效控制糖尿病情，减少热量的摄取和有效控制体重。冷害是水稻减产的重要原因，水稻各生育时期耐冷性在种间、种质之间存在差异。通常情况下，低温下植株的代谢变慢，植株产生的次生代谢产物黄酮、GABA及RS等功能成分的量有所不同。GABA在植物体内积累与代谢机制与质膜上的转运蛋白密切相关，这与水稻耐冷存在一定关系。育种实践中，农艺性状是水稻育种的重要指标。本研究对粳稻02428突变体RIL F6家系群糙米RS、GABA、总黄酮含量的遗传规律进行分析。同时，利用通径和逐步回归分析对各功能物质含量与主要农艺性状进行相关分析，为冷害条件下选育高生物活性成分含量水稻提供参考，也为水稻耐冷选育提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

重组自交系群体构建方法：

1.2 方法

将亲本及其F6代种植于云南省农业科学院试验场（昆明海拔1 916 m，7月22-27日每天14：00实测温度20.2～13.8℃，自然冷害）。3月25日播种、5月12日移栽。随机区组设计，2次重复；插秧规格20 cm×10 cm，单本栽插，1行区，每行11株，常规栽培管理。成熟后，按《稻种资源观察调查项目及记载标准》调查株高、穗颈长、穗下节长、剑叶长、剑叶宽、穗长、1～2节长、实粒数、秕粒数、结实率。每小区全部调查，以其平均值作为统计单位进行考种。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 总黄酮含量测定

采用硝酸铝络合比色法测定总黄酮含量。准确称取糙米样品(500 ± 1) mg于10 mL带盖离心管中，每管加5 mL 50%乙醇，置于振荡器上（200次/min）振荡 1 h。取上清液于另一离心管，5 000 r/min离心3 min，离心之后取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加0.6 mL 5% 亚硝酸钠，混匀后静置5 min；加0.6 mL 10%的硝酸铝，混匀后静置6 min；加4 mL 5% 氢氧化钠，混匀后静置10 min，在波长500 nm处测定吸光值。从Sigma公司购买的芦丁标准样品浓度（2、3、4、5、6、7 mg/mL）与其吸光度之间呈良好的线性关系：y=1 512.4x-24.828，相关系数R2=0.999。说明测定方法可行，准确性高、结果稳定。

1.3.2 GABA含量测定

采用比色法测定GABA的含量。准确称取糙米样品（500 ± 1） mg于10 mL带盖离心管中，每管加5 mL蒸馏水，置于振荡器上（200次/min）振荡 4 h。取上清液于另一离心管，10 000 r/min离心3 min，离心之后取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加0.2 mol/L（pH9.0）硼酸盐缓冲液0.6 mL、5%苯酚溶液2 mL、7%次氯酸钠溶液2 mL，摇匀后放入沸水浴加热5 min，直到颜色变成黄绿色，取出冰浴5 min，待温度升至室温，于645 nm处测定溶液的吸光度。从Sigma公司购买的GABA标准样品浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL）与其吸光值具有良好的线性关系： y=44.361x-1.457，相关系数为R2=0.998。说明测定方法可行，准确性高、结果稳定。

1.3.3 RS含量测定

采用Goñi法测定RS含量。称取（100 ±1）mg样品于10 mL带盖离心试管底部，每管内加胰α-淀粉酶反应液4.0 mL（3 000 U/mL），放入37 ℃的水浴恒温振荡器中（200次/min）水解，16 h后取出。加4.0 mL 95%乙醇后在离心机上于5 000 r/min离心5 min，弃上清液，向剩下的沉淀中加4.0 mL醋酸钠缓冲溶液（pH3.8）摇匀，加入1 000 μL 葡萄糖糖化酶液（3 000 U/mL），放入50 ℃水浴恒温振荡器中（200次/min），30 min后取出。3 000 r/min离心2 min，吸取上清液2.0 mL于25 mL容量瓶，加5%苯酚溶液1.0 mL，混匀后迅速滴加浓硫酸7 mL，摇匀室温放置5 min，然后置冷水中冷却10 min，在485 nm波长处测定吸光值。以加蒸馏水代替水解液制作空白，以0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%分析纯蔗糖梯度溶液作标准直线，硫酸苯酚法显色，标样试验重复进行3次，求得其回归方程为： y=1.625 x-0.022，相关系数R2=0.994 8，具有良好的线性关系，说明测定方法可行，准确性高、结果稳定。

1.4 数据分析

选择2组平行变数水稻糙米GABA和总黄酮含量与农艺性状。再以农艺性状作为自变量（Qi），把水稻糙米GABA和总黄酮含量作为因变量（R^），采用统计软件SPSS 19进行通径和逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 RS、总黄酮、GABA含量及其分布

群体F6代RS、总黄酮、GABA含量为RS（6 462 mg/kg）＞ 总黄酮（697.4 mg/kg）＞ GABA（232.6 mg/kg），其中总黄酮和GABA的偏度和峰度绝对值均＜1.96，呈正态分布，而RS的偏度和峰度绝对值均＞1.96，呈偏态分布，GABA和总黄酮含量在一定范围内变化具有连续性，且各株系间变化幅度较大，说明水稻GABA和总黄酮含量受数量性状控制，是一种数量性状（图1）。

图1 F6代RS、GABA和总黄酮含量正态分布图

2.2 RS、总黄酮、GABA与耐冷指标的相关性

由表1可知，F5和F6代中GABA含量与实粒数、秕粒数、总粒数、结实率4个耐冷指标都达到显著或极显著相关水平，而无论是F5还是F6代，RS含量都与实粒数、秕粒数、总粒数、结实率4个耐冷指标无明显相关性。

表1 F5和F6代耐冷指标与RS、总黄酮、GABA的相关性

2.3 亲本和RIL群体RS、总黄酮、GABA含量遗传分析

对亲本和RIL群体RS、总黄酮、GABA含量进行遗传分析可知，GABA和总黄酮含量存在较大的遗传变异差异。GABA含量在RIL群体平均值为678 mg/kg，明显低于两亲本，总黄酮含量在RIL群体平均值为191 mg/kg，高于两亲本。GABA和总黄酮含量遗传变异系数分别为20.61%和54.73%，遗传变异范围分别为0.415%～1.904%和0.053%～0.81%。所以RIL群体中GABA和总黄酮含量遗传变异差异较大，在育种中选育高GABA和总黄酮含量品种时选择空间较大，具有巨大的遗传潜力。

表2 亲本和RIL群体GABA和总黄酮含量遗传分析

2.4 主要农艺性状与GABA含量遗传通径分析

对糙米主要农艺性状和GABA含量进行遗传通径分析，见表3。在主要农艺性状中只有穗长、穗下节长和实粒数的直接通径系数为正值，与GABA含量成正相关，促进GABA含量的升高，其余直接通径系数均为负值，与GABA含量成负相关。对糙米GABA含量影响最大的是秕粒数，结实率次之。间接通径分析中，穗下节长和实粒数的间接通径系数为负值，其余的各主要农艺性状间接通径系数为正值。此外，直接通径系数小于间接通径系数的农艺性状有剑叶宽和结实率，说明剑叶宽和结实率对GABA含量的影响与其他农艺性状的间接作用有关，其中影响剑叶宽对GABA含量间接作用最大的是实粒数（0.051 4），影响结实率对GABA含量间接作用最大的是秕粒数（0.241 5）。

表3 主要农艺性状与GABA含量遗传通径分析

2.5 主要农艺性状与总黄酮含量遗传通径分析

对糙米主要农艺性状和总黄酮含量进行遗传通径分析，见表4。在主要农艺性状中剑叶长、株高、实粒数和穗颈长的直接通径系数为负值，与总黄酮含量成负相关，限制总黄酮含量的升高，其余直接通径系数均为正值，与总黄酮含量成正相关。对糙米总黄酮含量影响最大的是实粒数，秕粒数次之。间接通径分析中，结实率、秕粒数、穗下节长和穗长的间接通径系数为负值，其余的各主要农艺性状间接通径系数为正值。此外，直接通径系数小于间接通径系数的农艺性状有剑叶长和结实率，说明剑叶长和结实率对总黄酮含量的影响与其他农艺性状的间接作用有关，其中影响剑叶长对总黄酮含量间接作用最大的是穗下节长（0.148 3），影响结实率对总黄酮含量间接作用最大的是秕粒数（-0.226 8）。

表4 主要农艺性状与糙米总黄酮含量遗传通径分析

2.6 主要农艺性状对糙米GABA含量和总黄酮含量的逐步回归分析

把主要农艺性状对糙米GABA含量和总黄酮含量进行逐步回归分析，以株高（Q1）、剑叶长（Q2）、剑叶宽（Q3）、穗颈长（Q4）、穗下节长（Q5）、1～2节长（Q6）、穗长（Q7）、实粒数（Q8）、秕粒数（Q9）和结实率（Q10）为自变量，以糙米GABA含量和总黄酮含量为因变量（R^），分别进行逐步回归分析，建立回归方程。建立方程时，以自变量对因变量作用大小选择回归方程初始参数。方程中无显著变量可引入（F≥0.05），也无显著的变量可剔除（F≥0.01）。得出公式如下：

以上公式中，GABA的含量和总黄酮的含量多元相关系数分别为R=0.999 95和R=0.999 97，经检验均达到了极显著水平。分析表明，GABA的含量主要受结实率（Q10）的影响，而糙米总黄酮的含量受剑叶宽（Q3）和实粒数（Q8）两者影响，线性关系达到显著或极显著。

3 结论与讨论

本研究对糙米RS、GABA和总黄酮含量进行了遗传分析，其受到不同的性状影响，同一植物的不同部位之间存在明显差异。有学者对发芽糙米中GABA含量进行测定，发现发芽糙米GABA含量为普通糙米的7倍左右，可达0.428 1 mg/g。突变体RIL群里糙米GABA和总黄酮含量都存在丰富的变异，其GABA含量在0.415%～1.904%，平均值为0.678%、变异系数为20.61%；总黄酮含量在0.053%～0.81%，平均值为0.191%、变异系数为54.73%。在实际育种中选出高GABA和总黄酮含量的株系在理论上具有可行性。同时，研究还发现GABA和总黄酮含量在一定范围内变化具有连续性，且各株系间变化幅度较大，说明水稻GABA和总黄酮含量受数量性状控制，是一种数量性状，可为GABA和总黄酮QTL定位提供参考。

通过通径分析发现，秕粒数对糙米GABA含量影响最大，结实率次之；实粒数对糙米总黄酮含量影响最大，秕粒数次之。与糙米GABA含量直接通径系数为正值的农艺性状有穗长、穗下节长和实粒数，其他为负值；与糙米总黄酮含量直接通径系数为负值的农艺性状有剑叶长、株高、实粒数和穗颈长，其他为正值。这表明农艺性状中的秕粒数、实粒数和结实率可为选育高GABA和总黄酮水稻提供参考依据。

通过逐步回归方程分析得到了突变体RIL糙米GABA的含量主要受结实率的影响；而糙米总黄酮的含量受剑叶宽和实粒数影响，并且线性关系达到显著或极显著。因此，在选育生产中可借助回归方程指导功能型水稻选育。