CTX-M型超广谱β-内酰胺酶研究进展

刘保光，栗俞程，汪保英，白 明，苗明三，许二平

(1.河南中医药大学 科研实验中心，河南 郑州 450046；2.河南省仲景方药现代研究重点实验室，河南 郑州 450046)

近年来，随着兽用抗菌药的广泛应用，细菌耐药问题变得日趋严峻，已成为全球性难以解决的问题。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)能够水解含β-内酰胺环类的抗生素，可被β-内酰胺酶抑制剂抑制，其自身大多由质粒介导，同时是革兰氏阴性菌对β-内酰胺类抗生素耐药最主要的机制，具有广泛的水解酶活性[1]。产ESBLs的临床菌株，不仅对β-内酰胺环类药物耐药，而且还对氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物、多西环素、氟苯尼考等耐药[2]，表现出多重耐药特性。

CTX-M型ESBLs是一类对头孢噻肟具有强大水解能力的酶。前人研究发现，CTX-M型ESBLs耐药基因可以通过质粒、整合子、转座子等可移动元件，在质粒与染色体间，或从一个质粒到另一个质粒，或从一种细菌到另一种细菌进行转移，具有复杂的遗传传播背景[3-5]。为此，针对近些年有关CTX-M型ESBLs的研究进展进行了综述，以期为CTX-M型ESBLs菌株感染的防控和遗传背景的深入研究提供参考。

1 CTX-M型ESBLs的发现

BAUERNFEIND等[6]于1989年首次发现了耐头孢噻肟的1株大肠杆菌分离菌株(命名为CTX-M-1)。随后，阿根廷学者于1990年从1株耐头孢噻肟的沙门氏菌中检测到CTX-M-2型ESBLs[7]，CNIADKOWSKI等[8]在肠杆菌科细菌中发现了CTX-M-3型ESBLs。相继检出CTX-M型ESBLs感染菌株，使CTX-M型ESBLs菌株在众多国家、地区的各种临床菌株中得以流行，引起了人们对该型酶的很大关注，并迅速组成了一个稳定增长的ESBLs成员[9-10]。

2 CTX-M型ESBLs的种类

目前，已发现的CTX-M型ESBLs已达上百余种(http://www.lahey.org/studies)，呈现出快速增长的趋势。而CTX-M型ESBLs的携带菌，主要是变形杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性细菌，临床发现CTX-M型ESBLs对头孢噻肟具有较强的水解活性。依据基因同源性的不同，将CTX-M型酶分组 ：①CTX-M-1系列，包含12种酶；②CTX-M-2系列，包含8种酶；③CTX-M-8系列，仅包括这1种酶；④CTX-M-9系列，共11种酶；⑤CTX-M-25系列，包括CTX-M-25和CTX-M-26这2种酶[11]。

3 CTX-M型ESBLs的生化特性与产耐药性

CTX-M型ESBLs最主要的特征表现在大多数的CTX-M型ESBLs菌株对头孢噻肟的水解能力远高于对头孢他啶的水解能力。头孢他啶对产CTX-M型ESBLs菌株的最小中抑菌浓度(MIC)介于0.5～2.0 μg/mL，而头孢噻肟的MIC介于8～256 μg/mL[12]。可见，针对产CTX-M型ESBLs菌株，头孢噻肟的水解率较头孢他啶高出很多。因此，通过检测头孢他啶水解活性的高低，可以初步判断出大多数CTX-M型ESBLs与TEM、SHV型的不同，以此进行初步分型。

此外，CTX-M型ESBLs的菌株对β-内酰胺酶抑制剂是敏感的。在临床试验中，针对大多数产TEM、SHV型ESBLs菌株，舒巴坦的抑制活性没有克拉维酸强。分析其原因，这主要在于Arg-244位点能较好地与克拉维酸结合，该位点是TEM和SHV型ESBLs的重要位点。CTX-M型ESBLs菌株的Arg-276位点与Arg-244位点的结构有一定的差异[13]，这在一定程度上决定了β-内酰胺酶抑制剂发挥作用的差异。

氨基酸Asn-104-Glu突变后，CTX-M-14型酶对头孢噻肟的水解能力大大降低，而对第一、二代头孢类药物的水解能力影响不明显[14]。此外，根据已上传的蛋白质序列发现，在CTX-M型ESBLs菌株中普遍存在Ser237位点，由此可见，Ser237位点在影响产CTX-M型ESBLs菌株的水解活性方面发挥了重要的作用。BOYD等[15]研究表明，CTX-M型ESBLs第167、240位的氨基酸位点，与头孢他啶的水解活性能力有密切关系，这2个氨基酸位点能够促进CTX-M型ESBLs与头孢他啶的结合，使头孢他啶的水解活性高于头孢噻肟。

4 CTX-M型ESBLs的流行病学

大肠杆菌和肺炎克雷伯菌是产CTX-M型ESBLs菌株中最常见的细菌。自CTX-M-1型ESBLs首次报道以来，现今许多国家已发现产CTX-M型ESBLs菌株。在产ESBLs的肠杆菌科细菌中，CTX-M-2和CTX-M-3型ESBLs菌株占了重要比例[16]。在不同的国家和地区，携带ESBLs菌株的分离率及基因亚型种类也有较大差异，CTX-M-15型在印度、尼日利亚多见[17]，而CTX-M-9和CTX-M-14型在西班牙多见，我国台湾地区主要以CTX-M-3、CTX-M-14型为常见基因亚型[18-19]。

杜向党等[20]发现，河南地区鸡、猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的产生率较高, 以CTX-M-2型和CTX-M-9型为主。近年来，我国的浙江、北京、广州等地区的流行菌株主要以产CTX-M型ESBLs菌株为主，多数同时与产TEM型广谱酶共存。在检测的30株虎源大肠杆菌中，产ESBLs的菌株有21株，阳性率高达70%，而CTX-M型基因的检出率为50%[21]。赵凤菊等[22]研究发现，辽宁地区的产ESBLs猪源大肠杆菌的检出率较高，TEM型和TEM+CTX-M型为主要流行的基因型。可见，各地产CTX-M型ESBLs的菌株存在一定差异。

5 CTX-M型ESBLs基因可在质粒间、质粒和染色体之间转移

CTX-M型ESBLs编码基因通常位于质粒上，大多情况下与TEM-1共同存在于1个质粒上。此外，TEM-2、SHV及OXA-1型的基因还可能存在这个质粒上，质粒的大小介于在7～160 kb，这提示了这些质粒可携带多个或多类耐药基因[23]。体外试验发现，CTX-M型ESBLs的质粒通常可通过接合传递的方式传播，这可能是CTX-M型ESBLs菌株容易传播流行的原因。从产CTX-M-17型菌株中提取的质粒较小，在10 kb以下，不具有接合基因的功能，为非接合型质粒[24]。然而，这种较小的非自我传播的特殊质粒，也可以进行传播，它主要是通过转化的形式来实现。在波兰肠杆菌科的7种不同细菌中均发现了具有相同耐药性的CTX-M-3型的质粒[25]。

PALUCHA等[26]从临床分离的大肠杆菌中发现存在第二染色体插入的CTX-M型基因。在波兰华沙检测出2种性质截然不同的质粒上都携带CTX-M-3型基因[27]。我国在大肠杆菌和阴沟肠杆菌的质粒和染色体上同时检出CTX-M型ESBLs基因[28]。可见，CTX-M型基因能够移动，且移动能力很强，可使CTX-M型基因能够在质粒与质粒间及质粒和染色体间进行互相传递，从而达到快速散播的目的。

6 CTX-M型ESBLs的转位因子及基因转移的遗传环境

临床中携带的绝大部分CTX-M型ESBLs基因，主要是由可接合的能够转移的质粒所携带的，与之相关的转位因子，如插入序列ISEcp1、IS903、转座子及整合子等，目前还不明确。一些携带有ESBLs基因亚型(如CTX-M-2、CTX-M-3、CTX-M-9、CTX-M-15型等)的基因能够定位在转座子、整合子等可转移的元件上[29]。此外，位于CTX-M型基因上游的ISEcp1移动元件对耐药基因的传播发挥了重要的作用[30]。

6.1 ISEcp1、IS903插入序列

SINGH等[31]研究发现，产CTX-M型ESBLs基因的转移和表达与插入序列的性质有密切的关系。ECKERT等[32]研究发现，在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌等多种细菌中发现了ISEcp1插入序列，属于IS1380成员。CASELLA等[33]发现，插入序列ISEcp1在CTX-M型ESBLs基因的上游较为常见，CTX-M-14型基因的上游都存在ISEcp1，而其他CTX-M型的基因上游也大多存在ISEcp1。FERNANDEZ等[34]研究发现，ISEcp1序列常常位于CTX-M基因的上游，在特定情况下，可以提供CTX-M表达所需要的启动子。LARTIGUE等[35]研究发现，插入序列ISEcp1可以重复出现在携带CTX-M-l、2、3、9、13、14、15、17、19、21型基因上游的42～266 bp位置。其后发现CTX-M-14型和CTX-M-1型5的上游存在ISEcp1，同时发现在CTX-M-15型基因的下游也存在ISEcp1序列，这就阐释了CTX-M型基因的移动是一个较为复杂的过程[36]。

此外，DIESTRA等[37]发现，产CTX-M-14型基因的上游和下游分别存在插入序列ISEcp1和IS903，这与HU等[38]报道的CTX-M-14型基因的上下游分别出现插入序列ISEcp1、IS903相吻合。LARTIGUE等[39]发现，产CTX-M-14型基因的上游和下游也分别出现插入序列ISEcp1和IS903。可见，2个序列在CTX-M-14型基因的传播中具有重要的作用，能够使之进行大量传播，这揭示了CTX-M型ESBLs基因在肠杆菌科细菌中能够广泛传播。

ISEcp1插入序列，又称为转座单元，它是CTX-M型基因的重要传播载体。JIANG等[40]研究发现，常见的转座单元ISEcp1-CTX-M-IS903-iroN，IS903和iroN在CTX-M型基因的下游。LIU等[41]研究发现，ISEcp1转座单元中CTX-M型基因的表达水平与ISEcp1中的启动子(P1)有密切的关系。WANG等[42]研究发现，只有79、80、127 bp间距的单元具有P2活性。把二者进行对比，P1活性较强，它在促进下游基因的表达中占主导地位[43]。

6.2 整合子

整合子广泛存在于革兰氏阴性菌中。大多Ⅰ、Ⅱ类整合子与耐药有关[44]。SABATE等[45]研究发现，在Ⅰ类整合子(如InS21，In35和In60)中发现了产CTX-M-9和CTX-M-2型的基因。这些整合子，结构上包含有5′CS和部分或全部3′CS的副本。而对于整合子InS21，产CTX-M-2型的基因位于ORF513的下游，且在3′端保守序列内，它是一种非寻常整合子[46]。而对于In60，产CTX-M-9型的基因也位于ORF513的下游，也属非寻常整合子。

6.3 转座子

转座子是一个能够复制、移动的单元，存在于染色体DNA上，包含简单式和复合式。一般来说，简单转座子就是插入序列；而复合式转座予是一类带有某些特殊功能基因(如肠毒素基因、耐药基因、结构基因等)的转座子。在临床试验中，大部分CTX-M型基因是由转座子来调控的，这就加剧了细菌耐药性的传播[47]。耐药质粒是导致细菌产生耐药性的一个至关重要的因素，而质粒上的耐药基因，可通过耐药质粒的转化、接合等方式进行水平传播，在一定程度上加剧了细菌耐药性。马帅等[48]研究发现，产ESBLs菌株的同一质粒可以携带多种耐药基因，这些质粒可介导菌株的多重耐药特性，分离株的耐药性与耐药质粒的转移密切相关。

7 CTX-M型ESBLs的基因突变

7.1 CTX-M型ESBLs的残基

细菌携带的CTX-M型ESBLs基因在发生不断的突变，就是为了适应更多更新的抗菌药物。一些常见的残基如下。

残基77：第77位残基发生了A77→V的变化，虽然位于活性中心的远端，也能够对产CTX-M型β-内酰胺酶起到一定的催化作用，具有一定的温度耐受性。如CTX-M-55型在CTX-M-15基础上发生了A77→V突变，结果就表现出了对温度变化有一定的耐受性[49]。

残基109：经T109→A突变导致的，细菌携带的CTX-M-14型基因在109位的氨基酸是丙氨酸(Ala)，而CTX-M-140型是由CTX-M-14型突变而来，研究发现，109位的丙氨酸(Ala)对含CTX-M-14型基因水解头孢菌素起到了非常重要的作用[50]。

残基169：第169位残基位于A类β-内酰胺酶上，与酶对羧基、氨基、青霉素、头孢他啶的作用有很大的关系。

残基237和276：研究人员用点突变技术发现，突变后细菌对头孢噻肟的水解作用减弱。因此，推测Ser237和Arg276残基对头孢噻肟的水解作用具有特殊的增强作用[51]。

残基240：第240碱基主要是发生了D240→G突变。

7.2 产CTX-M型ESBLs的嵌合突变体

最近几年来，因相互发生嵌合作用出现了一些新的突变体，如CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合体CTX-M-64型、CTX-M-123型、CTX-M-132型和CTX-M-137型是在CTX-M-14型和CTX-M-15型的基础上发生突变的。而在CTX-M-123型基础上，通过若干个碱基突变或替换，这就衍变成了CTX-M-64型β-内酰胺酶，但它对头孢类药物的作用强于CTX-M-123型。与CTX-M-14型相比，而CTX-M-64型对头孢类药物的水解能力较强，同时也对酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦却表现出了一定的增加作用[52]。此外，CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合体还有CTX-M-137型[53]。

8 CTX-M型ESBLs菌株的流行原因及治疗措施

CTX-M型ESBLs的流行传播机制，主要包含水平传播和垂直传播两种形式。而水平传播主要是针对耐药基因来说的，通常是耐药基因在质粒、转座子、噬菌体、整合子等相关可移动元件的协助下来完成的，这也是引起临床耐药菌暴发和流行的主要原因，使得ESBLs的菌株能够通过一定的形式转移或传递给敏感的非产ESBLs型的菌株，这给临床的防控带来了一定的难度。

8.1 CTX-M型ESBLs菌株的流行原因

产ESBLs临床菌株，其所在的质粒不仅携带β-内酰胺类抗生素耐药基因，而且还同时存在其他耐药基因如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类药物的耐药基因，在这种情形下，就不可避免地出现了多重耐药，鉴于此，在临床中应及时地去检测产ESBLs菌株，协同相关药物的耐药表型，去判断是否为多重耐药菌株，这对于指导临床用药具有重要意义。再者，CTX-M型基因的本身理论特性在一定程度上也加剧了CTX-M型ESBLs菌株的广泛流行，其原因主要体现在以下两个方面：第一，这主要是在于CTX-M型耐药基因大多存在于可接合转移的质粒上，为流行传播提供了前提条件；第二，该移动质粒上携带的不同遗传元件(如插入序列、转座子和整合子等)在参与CTX-M型基因传播与表达中也起到了一定的不容忽视的作用。因此，在多种因素共同作用下，导致了菌株的耐药性传播越来越严重，目前，已达到一发不可收拾的地步，全世界耐药性问题变得日趋严峻。

另外，长期加量、滥用药物尤其是β-内酰胺类药物在一定程度上对动物机体产生了很大的危害，不仅会导致机体内的肠道菌群失调、紊乱甚至产生多重耐药性，而且还严重影响公共卫生的安全。临床中长期加量、滥用药物，而机体内代谢、吸收是有一定限度的，甚至有些药物不可能被完全吸收，导致其在体内蓄积，日积月累，蓄积的药物量增加。同时，因长期、大剂量使用药物，机体内不可避免地会出现耐药基因，这在一定程度上降低了药物的临床疗效，此外，还伴有一定的毒副作用。由于恶性循环的作用，机体内存在的耐药基因通过多种途径，可扩散、传播到环境(水、土壤、食品中等)中，进一步将耐药范围扩大，形成恶性循环式的全球性耐药问题。

8.2 CTX-M型ESBLs菌株的治疗措施

我国动物源CTX-M型ESBLs的菌株的分离率呈现增长趋势。在临床实践中，通过开展药物敏感性试验，选用较为敏感的药物去治疗相关动物疾病的感染。目前，碳青霉烯类抗生素如亚胺培南、美罗培南，本身具有特殊的空间结构特征，不容易被β-内酰胺酶降解，可治疗产ESBLs菌株的感染。目前，在临床实践中，抗菌活性最强、应用最为广泛的是美罗培南、亚胺培南。目前，针对产ESBLs菌株的感染，根据临床实践经历，选用β-内酰胺类和β-内酰胺酶抑制剂联用、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素去治疗较为合适。在其他类抗生素方面，氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素可用来治疗产CTX-M型ESBLs菌株的感染，具有一定的敏感性，但由于氟喹诺酮类抗生素对软骨发育有影响及氨基糖苷类抗生素的耳、肾毒性作用，在临床实践应用中受到一定的限制。

为有效控制细菌产生ESBLs和治疗产酶菌株的感染，第一，应当减少临床中抗生素的使用频次及注意合理科学用药，在一定程度上减少携带产CTX-M型的菌株[54]；第二，目前已有β-内酰胺酶抑制剂(如棒酸、他唑巴坦、舒巴坦等)应用于临床，可考虑联合应用β-内酰胺酶抑制剂；第三，加大研发力度，研制更多的中药、新药应用于临床[55]；第四，政府及监管部门应加强对感染菌、敏感程度的监测力度，在一定程度上降低或减少耐药菌株的出现。目前，随着CTX-M型ESBLs多重耐药菌株的出现，积极寻找新型、更加有效降低细菌耐药性的方案显得十分有必要。

9 小结

近年来，临床中携带CTX-M型β-内酰胺酶基因菌株显示出愈发流行的趋势。当前，伴随着科学技术的快速发展，新型检测技术层出不穷，如脉冲场凝胶电泳、MLST、RAPD等新型分型技术被广泛应用于基因检测与基因分子分型中[56]。了解不同地区产β-内酰胺酶的流行趋势，有效掌握CTX-M型β-内酰胺酶的亚型及分类特点，然后适当选用不同的抗菌药物进行治疗是很有必要的，对临床指导合理用药具有重要现实意义。

总之，随着对CTX-M型ESBLs的不断认识，且耐药性是一个世界性热点问题，在临床实践中，应重视ESBLs菌株的临床检测和加强该酶型的监测力度。不同类型ESBLs基因的获得和传播，在一定程度上，与相关的整合子、转座子和接合性质粒等可移动遗传元件有着很大的关联，而这些元件可以在不同菌株间进行快速的传播和转移，这就导致了携带的ESBLs基因检出率高。一些可移动的遗传元件可以快速有效地传递ESBLs基因，而且各种可移动遗传元件之间可能也会发生相互作用、相互影响，这些都会使对可移动遗传元件的研究变得更为复杂。鉴于此，可移动遗传元件对ESBLs基因、其他基因传播的影响及其传播扩散机制还需要进行深入细致研究。