间充质干细胞修复盆底功能障碍性疾病的进展

韩晓瑾，叶进培，平 毅

(1.山西医科大学第二医院，山西 太原 030001；2.山西大学生物医院研究院，山西 太原 030006)

盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)发病率较高，严重影响着女性的生活质量，给患者带来了巨大的心理压力和经济负担，已引起全世界盆底医学研究者的广泛重视[1]。目前临床上对于症状严重的PFD患者以手术治疗为主，但术后仍存在较大的并发症及长期疗效的不确定，且随着社会进入老龄化时期，PFD患者越来越多。据美国一项研究显示，压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)和盆底器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)均为流行疾病，分别影响着15%～17%和3%～6%的女性[2]。因此迫切需要开发一种新的替代治疗方法，为PFD患者提供更安全、更持久的治疗效果。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有多向分化潜能、旁分泌功能强大的成体干细胞，近年来在组织工程与再生医学方面得到广泛地研究。基于MSCs的细胞治疗，也是盆底医学领域的研究热点，是一种很有临床应用前景的治疗策略，有可能成为彻底改变POP和SUI的治疗方法[3-5]。现对不同来源的MSCs在女性PFD中的研究进展进行综述。

1间充质干细胞的概述

MSCs主要是由中胚层来源的一种成体干细胞，目前已经在骨髓、脂肪、脐带、子宫内膜等组织中成功提取。不同来源MSCs的生物学功能特点大致相同，不仅具有多向分化潜能、自我更新和增殖的能力，还具有低免疫原性、免疫调节及归巢至损伤组织特性，在组织损伤修复、组织再生与重建等领域广泛应用[6-7]。自Friedenstein等[8]首次报道MSCs以来，已有多个动物实验及临床研究将其应用于细胞移植治疗，如肝衰竭[9]、心肌梗死[10]、伤口愈合[11]、神经退行性疾病[12]等组织损伤修复及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等自身免疫性疾病的治疗[13]。在宫腔粘连[14]、卵巢早衰[15]等妇科疾病中组织损伤修复中也有对MSCs的研究。在治疗PFD方面也有很大的应用潜力。

MSCs广泛应用于临床疾病治疗研究的主要机制有以下几点：

①多向分化潜能：在特定的条件下定向分化为受损组织细胞促进组织修复，利用其成软骨分化的潜能在软骨修复及再生方面得到广泛的研究[16]。②旁分泌及外分泌：通过分泌生物活性因子、趋化因子和细胞因子及释放细胞外囊泡等，可改善细胞的微环境、重构细胞外基质等。近年来MSCs来源的外泌体是成为干细胞领域研究的热点问题。Bai等[17]证实脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)来源的外泌体在皮瓣移植后缺血-再灌注(I/R)损伤过程能提高皮瓣成活，促进新生血管形成，减轻I/R损伤后皮瓣的炎症反应和细胞凋亡。③抗炎及免疫调节：可在炎性因子刺激下通过细胞间相关作用及MSCs分泌的可溶性细胞因子抑制免疫系统发挥抗炎作用。Kawata等[18]研究显示，给结肠炎模型小鼠早期注射ADSCs后，抗细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-10、转化生长因子-β(transforming growth factors-β，TGF-β) mRNA水平升高，而炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-17α mRNA水平明显降低。④促血管生成：MSCs不仅可分化为血管内皮细胞，也可分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质细胞因子-1等来调节内皮细胞分化促进血管再生。基于MSCs的这一作用，其还被广泛应用于缺血性疾病的研究中[19]，如缺血性脑卒中、糖尿病足等。⑤用于组织工程，与人工合成补片或生物材料网片上，创造出一种复合组织移植物，然后再移植回宿主体内继续再生过程，可改善人工合成或生物网片的生物相容性，降低生物网片的降解速率。

2不同来源间充质干细胞与PFD

2.1骨髓间充质干细胞在PFD中的应用

骨髓间充质干细胞(bone-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是最早应用于盆底功能修复中的MSCs类型[20]。多个研究已证实BMSCs具有向成纤维及骨骼肌分化的潜力及促进细胞外基质重构功能。Bing等[21]将BMSCs与盆底韧带成纤维细胞间接共培养后，分别于3天、6天、12天检测发现BMSCs中弹性蛋白、赖氨酰氧化酶(lysyloxidase，LOX)、Fbulin-5 mRNA的表达均增加，于第12天显著增多。Corcos等[20]和Du等[22]分别给SUI模型大鼠经尿道外括约肌区域注射大鼠BMSCs显示，BMSCs具有向骨骼肌表型分化的潜能，修复了受损的外尿道括约肌，明显改善了泄漏尿点压。Zhao等[23]研究发现机械拉伸刺激盆底韧带成纤维细胞可产生可溶性因子TGF-β及肌腱蛋白-C(tenascin-C，TNC)，激活和调节间接共培养BMSCs细胞内信号通路，促进BMSCs向成纤维细胞分化。Jin等[24]研究发现miR29a-3p是BMSCs内源性弹力蛋白表达的重要负调控因子，在BMSCs中添加miR-29a-3p抑制剂，然后将其移植到PFD大鼠体内，证实可显著提高弹性蛋白的表达和分泌，从而促进PFD大鼠BMSCs的治疗潜力。Zhao等[25]发现过氧化物酶增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR-γ)表达时BMSCs成纤维细胞的分化能力减弱，证明PPAR-γ负调节BMSCs成纤维细胞的分化。Jin等[26]通过基因修饰方式，将过表达弹性蛋白的BMSCs细胞移植到阴道扩张所致损伤成年大鼠体内，明显改善了尿动力学试验结果，进一步将聚乳酸乙醇酸(poly D,L-lactic/glycolic acid，PLGA)、纳米颗粒(NPs)与碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)组合，移植到PFD模型大鼠体内，使bFGF持续释放，进一步增强了过表达弹性蛋白的BMSCs向纤维分化的能力。但PFD大多数发生于中老年女性，随着年龄的增长，自体BMSCs的数量明显减少，增殖能力明显减弱，且需要在麻醉下穿刺获取，进而限制了自体移植的临床应用。

2.2脂肪源间充质干细胞在PFD中的应用

脂肪源间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)来源方便，通过简单抽脂术获得，患者易于接受，数量充分，是较理想的自体来源MSCs之一。ADSCs作为种子细胞，在盆底医学中的研究方面越来越多的受到重视。Arjmand等[27]采用尿道镜下经尿道及阴道入路注射自体ADSCs治疗10例SUI患者，在注射治疗后的2周、6周和24周，尿失禁明显减少，表明将自体ADSCs注射到尿道周围是一种安全、短期有效的治疗SUI的方法。Watanabe等[28]和Cui等[29]在SUI模型大鼠尿道注射ADSCs，发现尿道周围细胞外基质、平滑肌的含量增加，也证实ADSCs对SUI的治疗有效。Liu等[30]研究表明，ADSCs通过增加胶原合成和减少胶原溶解调节SUI妇女成纤维细胞胶原代谢，并从人ADSCs中分离纯化了外泌体，证明dil标记的外泌体可以转移到SUI女性培养成纤维细胞的细胞质中，进一步证明ADSC-Exos处理成纤维细胞后，培养成纤维细胞Ⅰ型胶原水平显著升高，还证实ADSC-Exos在SUI妇女成纤维细胞胶原代谢调控中发挥着重要的作用。以上研究均证实ADSCs可通过向成纤维细胞分化、旁分泌及外分泌功能促进胶原的表达，改善SUI症状。此外，ADSCs也可与生物材料结合，为盆底组织提供支撑，而且可以促进盆底组织的修复。Ochoa等[31]研究了人ADSCs接种前后对脱细胞猪真皮不同交联率的胶原网的力学性能及细胞与支架的相互作用，发现完全交联且接种ADSCs的胶原网弹性明显增强，可以作为修复盆腔器官脱垂的支架。Roman等[32]也将ADSCs与可降解聚乳酸(PLA)支架构建的复合组织移植物及无细胞接种PLA支架相比，植入ADSCs的PLA支架形成的新组织中血管新生更多。

以上研究显示脂肪是PFD治疗的一种理想的MSCs来源，具有极大的临床应用前景。但因年龄、抽取脂肪的部位和分离方法的不同，对获得ADSCs数量有很大的影响。

2.3脐带间充质干细胞在PFD中的应用

脐带是妊娠期间为母体和胎儿提供营养的主要通道，是人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)获取的来源，具有胚胎原性特性。hUC-MSCs可塑性强、无伦理学争议、数量充足、易于分离[33]，目前已建立完善的脐血库。多个体外及体内实验显示hUC-MSCs在盆底医学领域有很大的应用潜力。杨一等(2014年)使用bFGF诱导hUC-MSCs向成纤维细胞分化，促进了细胞外基质Ⅰ型胶原的分泌。Roman等[32]将hUC-MSCs与网片结合制造组织工程筋膜，皮下移植到实验大鼠阴道后壁内，发现新的组织中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量明显增加。Ding等[34]将hUC-MSCs接种于纳米纤维仿生网上，并将其植入动物模型中，未发现任何实验动物网片发生侵蚀，且新生组织血运较未结合hUC-MSCs者大。说明hUC-MSCs同样可以调节网片的生物学性能。因hUC-MSCs来自胎儿娩出后的脐带组织，要实现PFD自体移植治疗，需在出生时就保留脐带组织，提取MSCs，由专门的实验室保存。长期保存的管理费用、细胞移植的安全性等问题成为hUC-MSCs向临床应用转化的障碍。

2.4子宫内膜间充质干细胞在PFD中的应用

人类的子宫内膜是一个动态重建的组织，其高度的再生能力主要是由子宫内膜间充质干细胞(endometrium mesenchymal stem cells，eMSCs)介导的。eMSCs可从经血中分离，亦可通过诊断性刮宫术及子宫全切术后的标本中获取，较骨髓穿刺或脂肪抽取操作便捷，即使绝经后女性也可在排除禁忌症后应用雌激素刺激内膜生长以获取自体eMSCs[35]。有文献报道2004年首次从子宫内膜组织中分离出eMSCs[36]，并可通过流式细胞术或免疫磁珠进行分选[37]，是应用于PFD治疗的一个很容易获得的自体细胞来源，其成为具有吸引力、新的成体干细胞来源之一[38]。因eMSCs自身存在于女性盆底组织中，可能较骨髓、脂肪、脐带来源的MSCs对于PFD的治疗更具优势，成为干细胞治疗PFD的最佳种子细胞。Chen等[39]通过TGF-β对eMSCs进行诱导，证实eMSCs对阴道壁和骨盆底的平滑肌功能恢复有效。Ulrich等[40]将eMSCs与PA+G生物网片结合可使新生血管形成速度更快，血管密度更高，即使在90天内，新生血管形成的趋势仍保持在移植物种子网状结构的正常水平，eMSCs/PA+G网状纤维-组织界面的巨噬细胞较单独PA+G明显减少。在细胞种子网格周围沉积了更多的胶原纤维，这表明eMSCs可能促进了生理胶原的产生，从而PA+G生物网片提高了生物力学性能，减少了网片侵蚀、暴露等不良反应。Edwards等[41]将eMSCs与有凝胶涂层的尼龙网片结合共同应用于大鼠皮下组织，证明在植入之前接种eMSCs可减少异物反应，改善网状组织复合体的生物力学性能，发现eMSCs可调节胶原生成和排列以增强网片张力。

以上研究显示eMSCs在盆底医学有很大的研究价值。但eMSCs受年龄、体内激素水平、提取时子宫内膜周期状态等影响，获得的数量有所差异。

3间充质干细胞在PFD中应用的展望

MSCs通过定向诱导向成纤维、成肌分化，分泌生物活性因子及与生物材料的结合可能是未来PFD患者治疗的最佳方法之一。虽然MSCs在盆底医学领域显示巨大的潜力，吸引了越来越多研究者的目光，但在实现向临床转化之前，仍存在大量的问题，如MSCs分化能力受衰老、激素、免疫和代谢因子的影响[42]，如何保持其多向分化的潜能；怎样实现细胞移植，局部注射还是静脉注射；移植细胞的数量；移植后是否存在免疫排斥等，还需进一步考虑临床应用的安全性、经济效益。今后仍需要进行大量的动物实验研究。