骨髓间充质干细胞外泌体在骨质疏松中的研究进展

孙珂焕 朱晓峰 杨丽 王攀攀 李小云 张荣华*

1.暨南大学中医学院，广东 广州 510632 2.暨南大学药学院，广东 广州 510632 3.暨南大学附属第一医院，广东 广州 510630 4.暨南大学肿瘤研究所，广东 广州 510632

随着人口老龄化的加速，骨质疏松症(osteoporosis，OP)的发病率逐年增高[1]。最新数据显示，我国的患病人数已达1.4亿[2]，骨质疏松性骨折发病率不断增高，严重危害老龄人口的生活质量[3]。OP发病的根本原因在于骨吸收与骨形成的失衡，而目前防治多以抑制骨吸收的药物为主，虽然抑制了骨改建过程，但难以恢复已丢失的骨量，且存在诸多不良反应[4]。因此如何促进骨形成是近年来研究的热点[5]，同时探讨其相关分子生物学机制，对预防和治疗骨质疏松具有重大意义[6]。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)广泛存在于多种组织和器官中，是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。其中骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)研究最为广泛深入，其分化去向在骨代谢中扮演了重要角色，外部因素及其信号处理过程如何调控其分化去向是当前研究的热点[7]。目前学者们已从胞内信号转导通路、基因转录及转录后水平调控开展了大量研究，但决定BMSC分化的关键步骤与因子仍属深入探索的领域[8]。

外泌体(exosome)作为细胞间信号通讯的重要途径，也是干细胞最重要的旁分泌形式[9]，在BMSC间的信号传递并影响其分化走向方面扮演十分重要的角色。近年来研究表明细胞间的交流会对骨形成产生很大的影响[10]，外泌体能通过信号蛋白、miRNA 等方式调控BMSC增殖和分化，也有研究发现BMSC来源的外泌体可以通过调控宿主BMSC的成骨分化功能改善骨质疏松[11-12]，其在骨质疏松的发生、发展中起重要作用。本文现就BMSC来源的外泌体在OP中的研究进展进行综述。

1 外泌体的生物学特性

1.1 外泌体的概述

外泌体是由多种细胞分泌到胞外的纳米级膜性泡，直径约为30～100nm[13]，密度在1.13～1.21 g/mL，具有双层脂质膜结构[14]，成杯型或球状[15]，广泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁等多种体液中。含有蛋白质、脂类、mRNA、miRNA、细胞因子和转录因子受体等多种生物活性物质[16]，能作为信号分子传递给靶细胞，从而介导细胞间的物质传递与信息交流。

1.2 外泌体的形成

外泌体起源于胞内体途径[17]，其中最经典的途径是内吞体运输分拣复合物(endosomal sorting complexs required for transport，ESCRT)。细胞膜表面的跨膜蛋白被吞噬形成初级核内体，初级核内体与细胞内吞的囊泡融合，将囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收成为次级核内体后，ESCRT-0 复合体会结合泛素化蛋白，形成的ESCRT-I和ESCRT-II会调节腔内的小泡芽，形成的多泡体(multivesicular body，MVB)既可以被溶酶体降解，也可以通过胞吐作用将腔内的小泡释放到胞外空间形成外泌体。

1.3 外泌体的组成

外泌体含有丰富的蛋白质，其中一类非特异性表达包括四分子交联跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82)、 Alix、TSGl01和热休克蛋白等，可作为识别外泌体的蛋白标志物[18]。另一类是具有细胞源性的特异性蛋白质，如T细胞来源的外泌体携带有CD3分子[19]，破骨细胞源性的外泌体内含核因子-kb受体活化因子(RANK)[20]，这类蛋白质可能与细胞信号转导功能相关，在不同的生理病理条件下有表达的差异，具备生物学标志物的潜力，对疾病的诊断有重要意义。

外泌体包含的另一大类重要物质为核酸，包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA等，在细胞间的遗传物质信息传递过程中发挥重要作用，可调控生物信息，参与调节多种生理和病理过程[21]。在这些分子中，miRNA在基因表达方面的调控最受关注，其比例在外泌体中比母细胞更高[22]，且有研究表明，miRNA不是随机整合进入外泌体，而是母细胞具有的一种分类机制引导特定的细胞内miRNA进入外泌体[23]。

1.4 外泌体的生物学功能

外泌体的特异性功能与所含的蛋白质、核酸及所处的微环境密切相关，其发挥作用是通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，与靶细胞膜融合或内吞作用将信息传递给细胞进而行使生物学功能[24]。现阶段认为外泌体产生生物学效应的方式主要有：一是外泌体表面的蛋白分子或脂质配体直接激活靶细胞表面的受体，产生信号复合体并激活胞内信号通路；二是外泌体可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进入细胞，将自身携带的蛋白质、核酸、脂质等活性分子带到细胞内，激活靶细胞内相关信号通路，进而调控细胞的功能及生物学行为[25]。

2 BMSC外泌体在骨质疏松中的作用

2.1 外泌体参与BMSC的骨向分化

近年研究发现，外泌体在细胞成骨分化中具有重要作用，BMSC来源的外泌体可以促进成骨细胞(osteoblast，OB)的增殖和分化，提示它在骨修复或骨组织再生中的潜能[26]。有研究表明，抑制细胞Rab27a(外泌体释放启动因子)表达后，明显抑制了体外BMSC的成骨分化作用，而在培养体系中补充BMSC来源的外泌体则可以促进细胞的成骨分化作用[27]。Narayanan等[28]在探讨外泌体对成骨分化作用的研究中也发现相似的现象，同时发现从前成骨细胞MC3T3-E1中提取分离的外泌体可以促进BMSCs分化成OB，对胞内miRNAs的表达有显著的影响，而这些变化是通过激活Wnt信号通路来促进成骨分化。

目前也有研究显示，除了BMSC来源的外泌体，其他一些特定细胞或组织来源的外泌体可促进BMSC的成骨分化，但具体机制尚未阐明。Ekstrtom等[29]发现，人单核细胞分泌的外泌体对BMSC具有促成骨分化作用，该类外泌体与BMSC共培养后，其细胞表面的骨标志基因Runx2、BMP-2的表达与对照培养基相比均显著增加。人树突细胞来源的外泌体同样可以促进人BMSC向OB分化[30]，经作用后的BMSC碱性磷酸酶(ALP)的活性增高，Runx2表达升高，其促成骨分化作用可能与其内含有大量与成骨分化相关的基因和蛋白有关。因此，外泌体促进BMSC成骨分化的具体分子机制，仍需进一步研究证实。

2.2 BMSC外泌体miRNA参与调控BMSC的骨向分化

BMSC分泌的外泌体中含有多种miRNA[31]，并参与调控BMSC的成骨分化功能。因其在基因表达调控中的关键作用，外泌体miRNA的功能已经成为研究的焦点[32]。最近的研究揭示了许多参与骨骼重塑调控的骨源性外泌体miRNA，包括miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p等43个miRNA在MC3T3-E1外泌体中高表达，这些miRNA可能参与到成骨细胞分化和功能的多种途径中，如Wnt、TGF-β和钙信号通路[33]。

人BMSC在成骨分化的不同阶段中，其分泌的外泌体miRNA表达谱亦随之改变，其中let-7a、miR-135b、miR-148a、miR-199b、miR-203、miR-218、miR-219、miR-299-5p、miR-302b在成骨分化过程中显著上调，而miR-155、miR-181a、miR-221、miR-320c、miR-885-5p显著下调，且Wnt通路信号分子的富集与成骨相关的外泌体miRNA差异化分布同步，这表明BMSC分泌的外泌体miRNA调控其成骨分化功能[34]。Qin等[35]的研究显示，人BMSC来源的外泌体通过内吞作用进入成骨细胞内并传递成骨相关的miRNA，其中miRNA-196a对调节成骨ALP、OCN、Runx2的表达及对成骨细胞的活性和分化具有正向调控作用，予以BMSC来源的外泌体对颅骨缺损大鼠进行骨形成刺激，能促进骨缺损处新骨再生和血管生成。BMSC来源的外泌体miRNA在骨代谢平衡起重要调节作用，未来仍需要进一步探讨多种miRNA对OP的影响，以通过调控外泌体中多种miRNA的表达提高治疗OP的作用。

2.3 外泌体与成骨细胞

成骨细胞起源于BMSC，是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。Ge等[36-37]在研究成骨细胞外泌体并探索其潜在功能时，分离提取小鼠MC3T3外泌体并进行蛋白质组学分析，确定了1 536种蛋白质，其中172种蛋白质与骨骼数据库重叠，基因本体分析显示外泌体主要参与蛋白质的定位和胞内信号传导，蛋白质网络分析显示与骨骼肌系统发育和功能、发育障碍、遗传障碍和骨形成相关，其中EFNB1、转化生长因子受体3、LRP6、骨形态蛋白受体1、SMURF1和真核起始因子2在成骨形成中起着重要的作用，这些外泌体来源的有价值的蛋白可能为骨质疏松研究提供了新的前景。

也有研究发现，前成骨细胞MC3T3-E1细胞中提取分离的外泌体可以促进骨髓基质细胞(ST2)分化成成骨细胞，同时对胞内miRNA的表达有显著的影响，而这些变化是通过引起Axinl表达抑制及β-cateninn表达增强来激活Wnt信号通路来促进成骨分化[38]。这些发现均提示了外泌体介导骨细胞微环境中细胞间的交流模式及骨重建机制。

2.4 BMSC外泌体与骨质疏松

研究显示，BMSC外泌体可有效改善骨质疏松症状，促进BMSC增殖、成骨分化及骨再生。 Furuta等[39]应用CD9-/-小鼠建立骨折延迟愈合的动物模型，小鼠的骨愈合率明显低于野生型小鼠，而注射BMSC来源的外泌体能够促进软骨内成骨，加速骨折愈合，注射缺乏外泌体的培养基则未出现这种情况。叶庆元等[40]注射小鼠来源的供体BMSC，能够通过供体BMSC分泌外泌体转运miR-26恢复雌激素缺乏骨质疏松模型小鼠的BMSC功能并缓解骨质疏松，为研究如何缓解与治疗激素水平下调所造成的骨质疏松提供有一定的参考价值。另有研究报道，miR-31水平在老年人和骨质疏松症患者的血浆中显著升高，进一步研究发现，衰老内皮细胞来源的外泌体分泌的miR-31被BMSC摄取，从而抑制间充质干细胞的成骨分化，介导骨质疏松的发展。血浆外泌体来源的miR-31在骨质疏松的发病机制中发挥作用，可能是一种有价值的骨质疏松的生物标志物，可作为骨质疏松新的治疗靶点[41]。

此外，Liu等[42]研究表明正常BMSC分泌的外泌体可调控系统红斑狼疮所致的骨质疏松表型小鼠BMSC功能，增加小鼠的股骨密度，促进骨再生，改善狼疮所致骨质疏松症状况，机制研究显示由BMSC分泌的外泌体可将Fas蛋白转移至模型小鼠BMSC内，降低了细胞内miR-29b的水平，导致Dnmt1介导的Notch1启动子低甲基化的恢复。研究结果揭示了通过BMSC外泌体提供的Fas蛋白可调节miR-29b/Dnmt1/Notch表观遗传级联来改善BMSC功能。Qi等[43]研究人类诱导多能干细胞来源的间充质干细胞分泌的外泌体(exosomes secreted by mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells, hiPSC-MSC-Exos) incorporateHiPSC-MSC-Exos)在体外对去卵巢大鼠来源的BMSC增值和分化的影响，hiPSC-MSC-Exos可增强BMSC的增殖和ALP的活性，上调成骨细胞相关基因的mRNA和蛋白表达水平；进一步体内实验在骨质疏松合并颅骨缺损大鼠模型中验证，其外泌体能显著促进骨缺损处新骨再生和血管生成，且hiPSC-MSC-Exos的效果随着水平的增加而增加，这些作用的机制可能是通过外泌体内所包含的功能性蛋白、脂质、mRNA、miRNA释放作用于目的细胞所介导的，为骨质疏松的进一步研究和临床治疗提供了新的思路和方法。

3 BMSC外泌体在骨质疏松中的应用前景和展望

MSC在生理或病理条件下产生的外泌体是细胞间通信的中心介质，通过将蛋白质、脂质、mRNA等传递给临近或远处细胞，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关[20]。且在各种疾病模型中验证它们的功能与MSCs相似，在生物体内如修复组织损伤、抑制炎症反应和调节免疫系统等功能已得到证实[44]，且外泌体具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用等优势。

随着生物医学的发展，出现了空前数量的治疗疾病和延缓疾病进程的潜在靶标。然而很多靶标因为药物在多种类型细胞的胞内无法溶解或迅速被激活而不具有成药性。而外泌体本身具有药物载体的属性可作为一种潜在的药物载体备受关注，BMSC是目前被认为产生外泌体能力最强的细胞，且适合大量的外泌体的生产，是理想的天然药物传输载体[45]。同时BMSC分泌的外泌体的功能与其相似，但更具有保护和修复作用，又可减轻很多与BMSC移植有关的安全性问题，如组织骨化及钙化的风险，成瘤性的安全及免疫排斥问题。BMSC来源的外泌体参与BMSC间的信号传递并影响其分化走向，寻找外泌体中关键调控因素和药物作用靶点，可成为治疗骨质疏松的一种具有良好前景的新型策略。

虽然BMSC来源的外泌体具有良好的应用前景，但是目前应用还处于初期研究阶段。尽管在动物模型中已证实外泌体对促进骨形成具有一定的效果，但将外泌体应用于骨质疏松的治疗还面临许多难题。例如如何高效地提取外泌体，保证复杂分类系统规范和生物活性，同时在动物实验注射BMSC外泌体的最佳浓度和时间均不明确，及存在如何使其准确定位到靶组织和靶细胞等问题。随着对外泌体研究的不断深入，将更系统更准确地了解其与靶细胞之间的信号机制，对疾病的诊治和预防具有重要的意义，未来应用前景广阔。