产肠毒素大肠杆菌致使仔猪腹泻致病机理的研究进展

任敏敏1，徐 娥1，申露露1，王 珍3，项 云4，肖英平2

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.浙江农业科学院农产品质量标准研究所；3.绿城农科检测技术有限公司； 4.金华市农业科学研究院畜牧所)

1 仔猪腹泻概述

仔猪因肠道内尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响。引起仔猪腹泻的传染性因素主要是指传染性病原，有病毒性和细菌性。而细菌性腹泻主要是由大肠杆菌引起，可引起仔猪黄痢(又称早发性大肠杆菌病)、白痢(又称迟发性大肠杆菌病)[2]。仔猪黄痢是初生仔猪的急性、致死性传染病，主要发生于1周龄内仔猪，以1-3日龄最为常见，发病率(90%)和死亡率(50%)均很高。临诊症状以排黄色或黄白色水样粪便和迅速死亡为特征，病仔猪精神萎顿，粪便呈黄色浆状、腥臭，严重者肛门松弛，排粪失禁，沾污尾、会阴和后腿部，肛门和阴门呈红色。迅速衰弱，脱水、消瘦、昏迷至死亡。仔猪白痢主要发生于10-30日龄仔猪。发病率高，死亡率低，多发于寒冬、炎热季节，气候突变、阴雨潮湿、母猪饲料质量较差、母乳中含脂率过高等常常是本病的重要诱发因素。临床上以排灰白色浆状、糊状腥臭味稀粪为特征。仔猪大肠杆菌病是集约化猪场最常见的疾病之一，能够引起人或动物体产生腹泻的最常见的几种病原型大肠杆菌根据不同的生物学特性可以分为6种类型：弥散粘附性大肠杆菌(disperion adhesion Escherichia coli，DAEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli，EAEC)、肠致病性大肠杆菌(enteropathic Escherichia coli，EPEC)和产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)[3]。在这些病原型大肠杆菌中，ETEC为最主要的致病菌，是一种重要的能够在全球范围内引起疾病的病原，它能够引起新生仔猪的严重腹泻，给养猪业造成了巨大的经济损失，且损失日益严重[4]。

2 产肠毒素大肠杆菌

研究表明ETEC的主要毒力因子是黏附素(被称为菌毛的毛发状结构)、肠毒素(蛋白质或肽类物质)、水肿病毒素、内毒素、溶血素和EatA[5]。ETEC的毒力特性强烈依赖于黏附素(菌毛)和肠毒素的产生[6,7]，ETEC最常见的表面黏附抗原是菌毛(fimbriae)，1990年，人们将其进行分类[8]，大致分为F1(TyI或普通菌毛)、F2和F3(分别是人类ETEC的CFAI和CFAII)，动物ETEC的菌毛为F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F17(Fy/Att25)、F41和F18。在动物ETEC细菌中，F4(K88)菌毛至少有三种抗原类型：ab、ac和ad[9]。F18菌毛是一种受质粒调控的菌毛，断奶仔猪的水肿和腹泻疾病分别与它的两种抗原型ab和ac有密切的关系[10-12]。

2.1黏附素 黏附素是存在于细菌表面的某种特定的蛋白质结构或糖脂成分，存在于细菌的细胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等结构中，能够使细菌黏附到宿主靶细胞上，对细菌的定植起着重要的作用。黏附素又分为菌毛和非菌毛黏附物质，大肠杆菌的17种黏附素主要存在于肠致病性大肠杆菌、产Vero毒素大肠杆菌(verocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC)中，少数存在于肠聚集性大肠杆菌(EAEC)和肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)中，主要的寄主是人、牛、猪、兔等[13]。

2.1.1F4(K88)菌毛 F4ac是F4(K88)菌毛的三种病原型F4ab、F4ac和F4ad中最常见的一种类型[7]，且目前在世界范围内均是如此。其中“a”抗原区域相对保守，但是另一个抗原区域是可变的，因此研究者们将其分别定义为“b”、“c”和“d”。F4ab曾经是最常见的一种抗原类型，F4ad曾于1973年在欧洲出现过[14]。Choi和Chae等人检测了腹泻猪体内44株F4呈阳性的E．coli菌株后发现，有96%的E.coli载有F4ac菌毛基因，仅4%的E.coli载有F4ab菌毛基因[15]。研究者们用PCR的方法研究了从腹泻的断奶仔猪体内分离到的237株ETEC，发现0.8%属于F4ab，1.3%属于F4ad，而98%属于F4ac[16]。所有F4菌毛均能够将脂多糖和肠上皮细胞的糖缀合物相结合，并且还能够和肠道黏液及红细胞结合[17,18]。这三种菌毛的差别表现在抗原类型以及和肠上皮细胞结合特异性上。这是由于某些猪对这三种抗原类型均易感；有些对两种抗原易感(ab和ac，或ab和ad)；有些仅对一种抗原易感(ad或ab)；有些则对三种抗原均具有抗性[19]。

2.1.2F18菌毛 相较于F4(K88)、F5(K99)和F6(987P)，F18菌毛是一种发现较晚的菌毛，是一种1-2 μm长的柔软细丝状，像头发一样覆盖在菌体表面。F18菌毛具有特征性的锯齿形，并出现在F18ab和F18ac两种抗原中，其中F18ac在体外更容易表达[16]。F18 ETEC菌株通常能够产生耐热肠毒素(heat-stable enterotoxins)，而较少产生不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)[20]。

2.2肠毒素 大肠杆菌的致病性，并不是由于细菌本身对细胞的致病性引起的，而是由于细菌在体内大量繁殖产生大量的毒素[21]。如肠毒素，主要包括不耐热肠毒LT(heat-labile enterotoxin)以及耐热肠毒ST(heat-stable enterotoxin)两种，其中耐热肠毒又可分为耐热肠毒STa(heat-stable enterotoxin a)和耐热肠毒STb(heat-stable enterotoxin b)。

LT是一种88 kDa的蛋白质，它由一个A亚单位和五个B亚单位组成，5个完全相同的B亚单位形成环状五聚体，A亚单位位于中央[22]。LT对热敏感，60℃加热30 min即被破坏。不能透析，也不易分离，有抗原性。LT根据其抗原性可分LT-I和LT-Ⅱ，LT-Ⅱ不具备肠毒素活性，并且不会引起动物的疾病，LT-I和LT-Ⅱ的主要差别在于它们的B亚单位不同[23-24]。LT分子是由一个约28 ku的酶活性A亚基(LTA)和5个约11.5 ku的B亚基(LTB)组成，LTA和LTB具有不同的功能。LTA是毒素的毒力活性中心，它能催化细胞中与调控腺苷酸环化酶有关的一种膜蛋白腺苷二磷酸核糖基化，激活靶细胞cAMP，使cAMP 含量升高；LTB是毒素的免疫原性中心，可与靶细胞上的特异性受体GM1结合，介导LTA的进入，以产生毒素活性[25]。目前对LT的功能进行研究的有很多，如Horstman等人研究结果提示，由于LT在细菌表面和脂多糖(LPS)相结合，因此LT可能作为一种黏附素将细菌和肠上皮细胞表面的GM1神经节苷脂相结合[26]。此外Berberov等人的研究发现，将编码LT蛋白的基因敲除后，不但能使动物腹泻的程度减轻，而且减少了细菌向无菌猪肠道的定植[27]。这些发现则提示LT可能起着黏附素的作用。

耐热肠毒素STa，是一种小分子量蛋白(约2 KDa)，由18或19个氨基酸构成，具有3个链内二硫键；STa可溶于水和甲醇，在100 ℃加热30 min或121 ℃加热15 min仍可保持生物活性；耐多种有机溶剂和表面活性剂：抗各种蛋白酶水解，为肽类毒素中最特殊者[28]。

耐热肠毒素STb，是一种由48个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为5 kDa；成熟的STb具有四个半胱氨酸残基，可形成两个分子内二硫键；STb对热稳定，100 ℃加热30 min仍可保持生物活性；与STa不同，STb对蛋白酶等比较敏感，经胰蛋白酶或β-巯基乙醇处理后便会失去生物活性[29]。

3 ETEC的致病机理

3.1粘附素的定植过程 菌毛粘附素有助于ET EC附着在小肠黏膜上皮细胞及结膜层上。 ETEC通过消化道进入动物肠道后，不断繁殖，当细菌在小肠中达到一定的数量后，能够和小肠上皮的受体结合并黏附在上皮细胞上，或者利用特殊的菌毛黏附素，而黏附并覆盖于上皮细胞的黏液上。ETEC由纤毛抗原介导的粘附作用，使其能牢固地粘附在小肠粘膜上，避免被分泌的粘液、小肠蠕动、小肠绒毛的运动等所清除。

大肠杆菌对肠道细胞的粘着分两步：(1)粘着和定植：首先，菌毛粘附素结合在猪小肠上皮细胞刷状缘的受体上。大肠杆菌的菌毛顶部和周围布满了受体结合位点。受体的碳水化合物部分决定菌毛粘附素的特异性。在菌毛粘附素较为松散地结合于受体上以后，信号转导引发宿主细胞的蛋白磷酸化，同时细胞间 Ca2+升高，并发生肌醇三磷酸化，使细菌与受体以一种高特异性的方式相互结合，随后定植在肠道内繁殖。而无菌毛的菌体仅形成一种松散而短暂的结合，不产生毒素。ETEC定植的程度决定了动物的腹泻是否是由细菌感染引起的。能够产生F5、F6和F18型菌毛的ETEC大多定植在空肠和回肠的末端，F4+ETEC通常可以定植在整段空肠和回肠。F4菌毛可介导ETEC向各个年龄段的大部分猪的小肠内定植。因此，F4+ETEC向肠黏膜的定植可以发生在新生和断奶仔猪体内，并且还可能发生在育肥猪体内。并且由F4菌毛介导的黏附是ETEC种特异性的，大多发生在猪体内[28]。(2)促进细菌繁殖和毒素的产生：大肠杆菌一旦粘附在粘膜细胞，就开始大量繁殖。细菌在生长过程中，产生大量的毒素不断释放到肠道内。

3.2肠毒素导致腹泻的机理 ETEC的两种肠毒素进人肠道后，首先与肠壁上皮细胞受体GM1结合。LT与神经节苷酯GM1结合后激活肠上皮细胞的腺苷酸环化酶，使细胞质中的cAMP含量持续增加；ST与GM1结合后，激活肠上皮细胞的鸟苷酸环化酶，促使细胞浆中cGMP的水平上升，且两种肠毒素致病机理有异[30]。

LT的致病机理：单独的亚单位没有生物学活性，只有结合在一起才具有全毒素的生物学和化学特性。经典的LT致病机理为：首先B亚单位与上皮细胞膜GM1受体紧密结合，通过胞饮作用进入细胞，并经过内质网被转运。其具有ADP-核糖基化转移酶活性的A 亚单位从NAD上把一个ADP-核酸基团转移到GTP捆绑蛋白的a亚基上，激活细胞基底膜上的腺苷酸环化酶，从而引起细胞内cAMP 浓度升高，cAMP依赖性蛋白激酶被激活，造成上皮细胞膜氯离子通道的超常磷酸化及离子通道囊性纤维变性损伤，最终使上皮细胞分泌氯离子亢奋和绒毛顶端吸收NaCl受到抑制而引起分泌性腹泻[31]。近年来的研究还提出了一些新的LT致病机制，如LT可能通过促进花生四烯酸代谢产物的合成和释放，刺激肠道神经系统及激发肠道炎症反应等影响肠上皮细胞的分泌。

STa的致病机理：STa的激活作用具有专一性，这是由于STa对小肠粘膜颗粒性酶比可溶性酶具有更高的亲和力，同时小肠粘膜本身以颗粒性酶为主。研究发现，STa能够激活鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase)系统，进而导致细胞内cGMP增多[32]。有关STa激活酶的作用机理主要有两种学说[33]：一是“瀑布”学说，认为STa结合到细胞膜表面，打开钙离子通道，钙摄取增加，激活调钙蛋白，触发磷酸脂酶A，膜磷脂释放花生四烯酸, 后者的过氧化物及过氧化氢代谢物使鸟苷酸环化酶激活。但也有的学者认为，STa并不引起小肠细胞花生四烯酸的释放及改变膜脂成分。二是“直接偶联”学说，该学说认为STa激活鸟苷酸环化酶是直接的，不需要介导酶，即与已知腺苷酸环化酶激活机理相似，依靠ST受体复合物系统激活。 S.A.Waldman进行研究发现了小肠粘膜颗粒性鸟苷酸环化酶与ST受体偶联的新模式，即两者可能通过细胞骨架成分紧密相连。这种偶联可抵抗各种离子、非离子去垢剂、盐及尿素等的溶解，而其他组织上的酶可被上述物质所溶解，但ST受体抵抗溶解作用，说明其他组织中酶与受体无特殊偶联关系。进一步研究发现, 位于刷状缘的25 kD蛋白磷酸化后，在小肠可介导STa毒素诱导的离子转移[34]。推测ST的作用可能与霍乱肠毒素通过cAMP升高使Na泵磷酸化、Na 吸收障碍导致水泻的机理相似[30]，即cGMP使Cl-转运蛋白磷酸化，CI-主动转运受抑制，进而肠腔内电解质与水储留引起腹泻，使水、钠离子、碳酸根离子大量丧失，造成脱水、代谢性酸中毒、高血钾症，使心力衰竭，有部分病例还会急性死亡。

STb的致病作用：STb的作用机理尚不清楚，它不能激活鸟苷酸环化酶和腺甘酸环化酶，也不能利用环化酶激活旁路，但有研究认为STb在被胞饮之前是非特异性地结合到靶细胞膜上的[35]，STb会引起细胞内Ca2+浓度升高，但对cAMP或cGMP的浓度并没影响[36]。

4 展望

ETEC的毒力因子多而复杂，抗原性也不同， ETEC的研究方向是进一步从分子角度阐明其致病机理，明确毒力因子产生与致病性的关系，深入对各个毒力因子基因的研究，以期制定出更为有效的预防和防疫措施。