细胞自噬与瘢痕疙瘩的研究进展*

王其飞 综述 秦泽莲 审校

(北京大学第三医院成形外科，北京 100191)

瘢痕疙瘩是一种原因不明的病理性瘢痕。病变范围超过最初皮肤损伤界限，外观表现为高出皮肤表面、质硬和充血的结节状或条索状的病理性瘢痕[1]。作为整形外科、烧伤科和创伤外科的常见病和多发病，瘢痕疙瘩具有治疗抵抗和治疗后易复发的类肿瘤特征[2]，临床上以手术切除联合化疗或放疗为主要治疗方案。病理性瘢痕尤其瘢痕疙瘩严重影响外观和关节部位功能[3]，同时也影响微创治疗效果。自噬主要是用于降解异常细胞蛋白聚集体和受损细胞器的有效细胞内分解代谢途径，最初认为自噬主要是应答细胞应激反应，但更多证据表明它在多个生物过程中发挥正常的生理作用[4]，自噬水平异常可导致多种疾病发生。目前一些研究认为自噬水平异常与瘢痕疙瘩发生发展有关，通过调控自噬水平抑制瘢痕疙瘩的发生发展，将其缩小一定程度后有利于瘢痕的微创治疗。本文对自噬在瘢痕疙瘩中的可能作用进行文献总结。

1 细胞自噬

1.1 定义

“自噬”术语是由De Duve在1963年溶酶体国际会议上首次提出[5]。自噬最初的科学定义是递送细胞质内容物至溶酶体以降解[6]，是进化上高度保守的降解细胞内异常蛋白和受损细胞器以实现细胞稳态和自我更新的过程[7，8]。在哺乳动物细胞中自噬主要有3种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[9]，其中巨自噬是研究最广泛的经典自噬类型。它独特的特征是双膜囊泡(自噬体)的形成，含有用于降解的底物并最终与溶酶体融合，若无特殊注明，文献中所提的自噬均为巨自噬。微自噬是指不伴有自噬泡的形成，溶酶体直接内化并降解受损细胞器的过程。特定靶蛋白在分子伴侣介导作用下转运到溶酶体中降解的过程称为分子伴侣介导的自噬。

1.2 细胞自噬的诱导

许多因素可以刺激诱导自噬形成，主要因素是营养缺乏(例如氨基酸和葡萄糖)和生长因子(例如胰岛素和胰岛素样生长因子)的撤离，其他因素有细胞能量水平降低(例如ATP)、细胞外或细胞内应激(内质网应激、缺氧和氧化应激和病原性感染等)[10]。ULK(Unc-51-like kinase)复合物对自噬诱导起始至关重要，主要由ULK1/2、自噬相关基因13(autophagy related gene 13，ATG13)、ATG101和200 kD家族相互作用蛋白(family-interacting protein of 200 kD，FIP200)组成。ULK1/2是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，负责募集ATG蛋白；ATG13可由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)磷酸化并调控ULK复合物活性；ATG101结合并稳定ATG13；FIP200为ULK和ATG13提供支架[11]。AMP依赖的蛋白激酶 (adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)和mTOR可催化ULK1的磷酸化。在营养充足的条件下，AMPK失活，mTORC活化并磷酸化ULK1和ATG13，从而抑制自噬起始。在饥饿条件下AMPK活化，mTORC失活，活化的AMPK催化ULK1丝氨酸磷酸化从而促进自噬。

2 细胞自噬在正常皮肤中水平变化和作用

成纤维细胞是瘢痕疙瘩发生过程中主要效应细胞，研究正常皮肤成纤维细胞中自噬水平变化及其导致病理改变对瘢痕疙瘩的预防和治疗有一定启示作用。衰老和物理因素可导致正常皮肤成纤维细胞中自噬水平发生变化，同时自噬水平异常可导致纤维化病理改变。

2.1 衰老时正常皮肤细胞自噬水平变化

衰老常伴随着细胞自噬水平改变[12]。目前研究表明，就细胞自噬水平而言，体内皮肤组织标本细胞与体外培养的皮肤细胞衰老表型不同。Tashiro等[13]利用不同年龄女性的皮肤组织和培养的真皮成纤维细胞验证细胞自噬和皮肤老化之间的关系，透射电镜显示随着年龄增长，皮肤组织中新生双膜自噬体的数量增加；免疫荧光显微镜示老年真皮成纤维细胞中LC3-Ⅱ量较年轻真皮成纤维细胞显著增加。Demirovic等[14]体外培养的成纤维细胞系(来源40岁女性眼睑)，衰老细胞(第55代)LC3荧光强度是年轻细胞(第14代)的5倍，但是在健康年轻人(25～30岁)和老年人(60～65岁)的全厚度皮肤切片中未检测到LC3荧光强度有明显差异(P=0.418)。Kim等[15]比较15例年轻人(年龄9～18岁，平均12.7岁)包皮皮肤成纤维细胞和中老年人(年龄50～94岁，平均67岁)躯干皮肤成纤维细胞自噬活性，透射电子显微镜显示年轻人和老年人成纤维细胞每1 μm2细胞质区域的自噬体数量相似(年轻细胞：0.17±0.06，老年细胞：0.32±0.21，P=0.154)；蛋白质印迹分析示2组LC3-Ⅱ(年轻细胞：0.31±0.23，老年细胞：0.20±0.76，P=0.087)表达无明显差异;ELISA分析显示2组细胞p62基础水平差异无显著性(年轻细胞：11.3±5.13，老年细胞：13.4±4.97，P=0.293);RNA测序分析显示主要的自噬调节基因无年龄差异表达(与年轻细胞相比，老年细胞中自噬调节基因上调为FBXL2、HTR2B、MAPT、RAB33A，下调基因为HK2、SOGA3、BNIP3，P>0.05)。皮肤组织和体外培养细胞的自噬水平随衰老变化不同，原因可能为体内外培养环境差异和标本来源不同等。

2.2 物理因素作用时正常皮肤细胞自噬水平变化

氧化应激、缺氧和紫外线照射是影响细胞自噬水平的常见物理因素[16～18]，然而关于氧化应激和缺氧对正常皮肤成纤维细胞自噬水平影响研究较少。紫外线对自噬水平的影响与照射剂量有关，中小剂量促进自噬而高剂量抑制自噬。Wu等[19]使用不同剂量(0、2、4、8、12 J/cm2)长波紫外线(ultraviolet A，UVA)照射原代人真皮成纤维细胞，Western blot结果显示自噬相关蛋白ATG5和LC3-Ⅱ的表达以及电镜下自噬溶酶体的数量均随照射剂量递增而先增加后降低。张青松等[20]探讨中波紫外线(ultraviolet B，UVB)对皮肤成纤维细胞自噬水平影响，采用不同剂量(100、200、300、400 mJ/cm2)UVB照射培养的人皮肤成纤维细胞并于不同时间点观察，结果与Wu等基本一致。中小照射剂量的UVB促进成纤维细胞自噬，照射剂量进一步增加时细胞自噬呈下降趋势。中小剂量UVB照射的直接效应是上调细胞的自噬功能, 大剂量UVB使细胞损伤严重, 形态和生理功能发生改变, 自噬功能下降。

2.3 细胞自噬在正常皮肤中病理作用

细胞自噬水平上调可导致皮肤成纤维细胞纤维化。周行等[21]报道2-甲氧雌二醇可以下调自噬水平从而抑制纤维化达到预防瘢痕的目的。2-甲氧雌二醇是雌二醇的代谢产物，能显著抑制正常皮肤成纤维细胞活性，降低胶原表达。周行等[21]在低氧(1%)条件下给予不同浓度(0、5、10、25 μmol/L)2-甲氧雌二醇干预成纤维细胞，Western blot检测示HIF-α、Ⅰ型胶原和LC3-Ⅱ蛋白质水平降低，p62蛋白质水平升高，且效应呈剂量依赖性，结果表明可以通过调控自噬水平抑制纤维化预防瘢痕形成。

3 细胞自噬在瘢痕疙瘩发生和治疗中的机制进展

3.1 细胞自噬的发生机制

细胞自噬过程发生较为复杂，简而言之，当诱导信号抑制mTOR1时，随着ATG1/ULK复合物的形成触发巨自噬过程[22]。激活的ULK 复合物作用于 Bcl-2 凋亡蛋白复合体，释放出 Beclin-1 蛋白，游离的 Beclin-1 蛋白再与空泡分选蛋白 VPS34 (vacuolar protein sorting 34)、VPS15和ATG14L 等结合为磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基Ⅲ型(class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase, PI3KC3)复合物。ULK复合物与PI3KC3复合物相结合形成哺乳动物前自噬体结构。ULK 复合物、PI3KC3复合物、WIPI2b(WD-repeat domain Phosphoinositide Interacting)和轻链蛋白3(light chain 3，LC3)等共同结合于内质网上特定的区域，催化产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)。 PI3P可以特异性地结合多种效应蛋白如 WIPIs、锌指蛋白等，促进孤立膜结构形成。吞噬细胞伸长取决于2个泛素样缀合级联，即ATG5-ATG12和微管相关轻链3(MAP-LC3/ATG8/LC3)缀合系统[4]。当吞噬细胞伸长时，逐渐吞噬一部分细胞质，通过自身融合形成双膜自噬体。最后，自噬体与溶酶体的融合导致自溶酶体的形成和内容物降解[23]，降解产生的大分子被释放回细胞胞质中以供再利用。

3.2 自噬在瘢痕疙瘩发生中的机制进展

瘢痕疙瘩分为缺氧中心区和常氧边缘区，两部位因氧浓度不同而表现生理功能有所差异。低氧作为常见的应激因素可导致自噬水平变化[24]。Okuno等[25]报道瘢痕疙瘩缺氧中心区成纤维细胞中自噬水平较高，他们基于HE染色标本的形态和CD31的表达观察，将瘢痕疙瘩分为缺氧中心和常氧边缘区，然后使用免疫组织化学分析和双标记免疫荧光方法检测人类瘢痕疙瘩样品中自噬蛋白(LC3和泛组织蛋白酶)和转录因子HIF同种型的表达和细胞定位。在中心区域中成纤维细胞表现出比边缘区成纤维细胞更多的自噬现象，HIF-1α表达水平也更高。相反，HIF-2α的表达在外周区的成纤维细胞和内皮细胞中上调。这些结果表明瘢痕疙瘩缺氧区成纤维细胞中自噬上调，该研究首次报道瘢痕疙瘩不同区域成纤维细胞中自噬标志物差异表达，对瘢痕疙瘩的治疗提供新思路。

3.3 细胞自噬在瘢痕疙瘩治疗中的机制进展

3.3.1 细胞自噬在光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)治疗瘢痕疙瘩中的作用机制

PDT是一种具有微创和定位准确的治疗瘢痕疙瘩的方法[26]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是血红素生物合成的前体，可以酶促转化为原卟啉Ⅸ，后者又与组织穿透光相互作用产生最终诱导细胞破坏的活性氧。Liu等[27]以5-ALA-PDT(5-ALA剂量1 Mm/ml，激光功率密度为2 J/cm2)处理瘢痕疙瘩成纤维细胞后细胞活性降低，说明该方法治疗瘢痕疙瘩具有可行性。电子显微镜下观察到自噬体和自噬溶酶体在处理后均在细胞中显著积累，蛋白质印记显示LC3-Ⅱ表达增加而p62显著降低；经 mRFP-GFPLC3B转染细胞后5-ALA-PDT处理组细胞自噬潮明显增加。给予自噬抑制剂3-MA明显抑制5-ALA-PDT诱导的细胞死亡，表明5-ALA-PDT通过促进瘢痕疙瘩成纤维细胞自噬水平而诱导细胞死亡。

研究证实SIRT1-SIRT3-SOD2-mROS通路上调抑制自噬水平[27]。SIRT1和SIRT3是沉默信息调节因子2(Sir2)蛋白家族的2个成员[28，29]。5-ALA-PDT以时间依赖性方式诱导SIRT1蛋白降解,而 SIRT1可能抑制SIRT3-SOD2通路的活性。SOD2是主要的线粒体氧化清除剂，在ROS的调节中起关键作用[30]。Liu等[27]研究表明5-ALA-PDT以时间依赖性方式显着增加SIRT3蛋白水平和SOD2活性，而不改变SOD2蛋白水平。ROS增强细胞自噬水平，给予线粒体抗氧化剂Mito-TEMPO(线粒体靶向SOD模拟物)处理后mROS明显下降，LC3-Ⅱ表达水平下降。SIRT1-SIRT3-SOD2-mROS依赖性自噬途径下调影响5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩的治疗效果。

3.3.2 细胞自噬在药物治疗瘢痕疙瘩中的作用机制

雷帕霉素作为常见的自噬诱导剂，在肿瘤、神经系统和骨骼中研究较为深入[31～33]，对瘢痕疙瘩治疗机制和效果不甚明确。作为一种大环内酯类化合物，可通过与mTOR 结合阻断mTOR 信号通路，激活细胞自噬，促进异常蛋白质或病变细胞的吞噬、凋亡，已成为临床上治疗及预防多种疾病的靶向新途径。陈琳等[34]利用蛋白质印记和免疫组化检测瘢痕疙瘩和正常皮肤真皮成纤维细胞自噬标志物LC3的表达水平的差异，并用雷帕霉素干预瘢痕疙瘩成纤维细胞检测Collagen Ⅰ和SMA的表达情况，结果显示瘢痕疙瘩中LC3表达高于正常皮肤，雷帕霉素可降低瘢痕疙瘩成纤维细胞中Collagen Ⅰ和SMA的表达，表明自噬参与瘢痕疙瘩发病过程，雷帕霉素诱导自噬进而调控成纤维细胞合成胶原及向肌成纤维细胞分化来抑制瘢痕疙瘩的发生。高景等[35]用不同浓度的雷帕霉素处理人瘢痕疙瘩成纤维细胞，MTS检测法显示雷帕霉素抑制细胞生长。透射电镜观察处理组自噬小体的双层膜结构较对照组明显增多，Western blot检测自噬相关蛋白LC3的表达增加，mTOR信号通路下游基因4EBPl(10、50、100 nmol/L雷帕霉素处理组的基因表达与未处理组的比值分别为0.87±0.03、0.38±0.07、0.22±0.09，P<0.05)和p70S6K(10、50、100 nmol/L雷帕霉素处理组的基因表达与未处理组的比值分别为0.68±0.03、0.55±0.03、0.31±0.06，P<0.05)的表达均有下调，参与调控细胞自噬的miR-885-3p、miR-204、miR-101、miR-376b(10、50、100 nmol/L雷帕霉素处理组以上4种miRNA基因表达与未处理组的比值分别1.56±0.24、5.25±0.72、10.10±0.58，1.97±0.42、2.94±0.22、4.16±0.36，1.71±0.23、3.29±0.35、5.02±0.33，1.49±0.16、2.74±0.12、3.73±0.19，50、100 nmol/L处理组与对照组比较差异均有统计学意义，P<0.05)表达水平上升，miR-30a(0.73±0.07、0.50±0.07、0.22±0.05，50、100 nmol/L处理组与对照组比较差异均有统计学意义，P<0.05)表达水平下降。以上结果表明自噬参与雷帕霉素抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性，通过雷帕霉素干预细胞自噬可能是一种有效的治疗瘢痕的途径。

苦参碱是从豆科植物中分离获得的生物碱，具有抗肿瘤[36]和抗纤维化[37，38]功能，通过诱导细胞分化、抑制侵袭和迁移达到抗肿瘤效果，通过抑制肺间质细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成从而抑制肺纤维化的发展。然而，该药对具有类肿瘤和纤维化增生特性的瘢痕疙瘩作用机制研究甚少。徐志山等[39]对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞给予0、10、20 μmol/L浓度的苦参碱处理，结果显示苦参碱以剂量依赖性抑制成纤维细胞的增殖并促进细胞凋亡，Western blot检测显示抗自噬相关蛋白LC3-Ⅰ的表达下降，促自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达升高，表明苦参碱能够影响自噬相关蛋白表达促进自噬，进而影响瘢痕疙瘩成纤维细胞功能。

4 小结

瘢痕疙瘩具有治疗抵抗和术后易复发的特征，深入研究发病机制更有利于瘢痕疙瘩的预防和治疗。细胞自噬是细胞应激时的一种生理变化，当水平异常时可以导致多种疾病发生，因此，对细胞自噬的研究具有重要的理论意义。细胞自噬与瘢痕疙瘩发生和治疗关系的报道较少，仅有光动力疗法、雷帕霉素和苦参碱对瘢痕疙瘩的治疗，但这些治疗方案都不是治疗瘢痕疙瘩的主流。期望今后更多研究探讨放射治疗、抗肿瘤药物、激素和硅凝胶等临床常用方案对瘢痕疙瘩自噬活性的影响并更加深入研究 PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR等自噬相关通路的作用。