选择性剪接在慢性髓系白血病耐药中的意义*

秦婷玉 刘静 王小中

选择性剪接（alternative splicing，AS）是指mRNA前体（pre-mRNA）经剪接形成多种不同的成熟mRNA异构体，生成结构和功能各异的蛋白质一系列过程。研究表明，此过程约在92%～94%的人类基因中发生，并且每个人类基因平均至少有5个转录物的异构体［1］。诸多研究已证实，大部分肿瘤生物学过程（如代谢、细胞凋亡、细胞周期控制、侵袭、转移和血管生成等）均受到AS 的影响［2-6］；同样在慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）中，也存在着AS事件，对CML 的发生、进展、耐药及免疫逃逸具有重要作用。本文综述AS与CML耐药的相关性，从CML的耐药机制出发，以期发现新的治疗靶点。

1 AS及其调控

AS 主要是由剪接体影响的转录过程，剪接体是由5 种小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs：U1、U2、U4、U5、U6）、19 种复合物（nineteen complex，NTC）以及NTC 相关复合物（NTCrelated complex，NTR）等其他辅助蛋白构成［7］。研究表明，酵母中含有8 种不同状态的剪接体，覆盖了从组装到被激活，从两步交酯反应到剪接体解聚的整个剪接通路，其中在预催化剪接体前体中首次观察到U1 snRNP 对5'剪接位点的识别［8］，剪接为RNA 依赖性ATP酶/解旋酶驱动的过程［9］。鉴于基因表达调控的复杂性，便于进行高保真度的有效剪接，不仅通过富含丝氨酸/精氨酸的蛋白（serine/arginine-rich protein，SR protein）、核不均一核糖蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）在内的RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBPs）的相互作用［10］，还通过剪接位点周围基因序列突变的顺式调控作用，以及寡聚嘧啶序列影响来调控基因的AS［11］。最近还发现可以通过PANDAR、SPA 和asFGFR2等lncRNA调控靶基因的AS过程［12］；甲基转移酶METTL16、去甲基酶ALKBH5 和YTH 结构域蛋 白YTHDC1等N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰也可通过改变SF 与m6A 甲基化RNA 之间的相互作用能力来调控AS［13］。

2 AS与肿瘤耐药

肿瘤治疗的主要挑战之一为最初对治疗反应良好的肿瘤最终对药物产生耐药性［14］。如组成型活性AR-V7剪接异构体有助于前列腺癌患者对恩杂鲁胺和阿比特龙的抗性［15］；PIK3CD-S 剪接异构体在前列腺癌小鼠异种移植模型中有助于小鼠对PI3Kδ 抑制剂CAL-101的抗性［16］；携带BRAF剪接异构体的黑色素瘤患者表现出对RAF 抑制剂威罗菲尼的抗性［17］；BRCA1-Δ11q 异构体高表达促进乳腺癌和卵巢癌药物耐药的发生［18］；雌激素受体ERα36 亚型与他莫昔芬耐药乳腺癌中干细胞标志物醛脱氢酶1A1（aldehyde dehydrogenase 1a1）的表达共定位并呈正相关［19］。同样，研究表明越来越多剪接调控因子与耐药性的诱导有关。如CLL患者SF3B1 基因突变显示与氟达拉滨治疗耐药相关［20］；SRSF1癌基因介导肺腺癌对卡铂和紫杉醇的耐药性［21］；在胰腺癌细胞中通过siRNA 下调SRPK1导致细胞凋亡和对顺铂和吉西他滨的敏感性增加［22］。针对上述肿瘤耐药情况的发生，通过设计特定的siRNA、反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）或小分子抑制剂纠正基因异常剪接，使肿瘤细胞对治疗药物重新敏感。

3 AS与CML耐药

最近研究表明，酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase，TKI），如伊马替尼（imatinib，IM）、吉非替尼和厄洛替尼等耐药的发生不仅与BCR-ABL 基因激酶结构域中出现点突变有关，也与CML 中广泛异常的AS事件存在密切联系。外显子芯片研究表明［23］，与正常K562 细胞相比，伊马替尼（imatinib，IM）处理的K562细胞共有185个差异表达基因和227个异常AS事件。如BCR-ABL35INS［24］、m-GSK3β［25］、Bcl-2 家族成员（Mcl-1、Bcl-x 和BID）［26］、BIM-γ［27］、PKM2［28］、Gfi1b-sp2［29］、CD44R1［30］等AS 异常剪接事件的发生与CML耐药密切相关。本文选取研究较为深入的基因进行详细论述，从而寻求更为安全有效的临床治疗手段。

3.1 BCR-ABL

在CML 患者中，BCR-ABL1 激酶结构域中的点突变为TKI 治疗失败的最常见原因。O'Hare 等［31］研究表明，BCR-ABL 剪接突变体BCR-ABL1 35INS（外显子8、9 之间的部分内含子保留）不能在稳转的Ba/F3 和K562 细胞中赋予对TKI 的抗性，但BCR-ABL1 35INS 可能在野生型BCR-ABL1 存在下赋予TKI 抗性。Abdullaev 等［32］研究表明，外显子7 缺失的BCRABL1剪接体翻译后未经历蛋白酶体降解，并与“野生型”BCR-ABL1 蛋白异二聚化，该过程可引起构象变化，并导致与“野生型”BCR-ABL1酪氨酸激酶的ATP结合位点相结合的抑制剂被破坏，从而导致对第一代和第二代TKI的抗性。

3.2 Bcl-x

Bcl-x 通过AS 编码长型抗凋亡蛋白Bcl-xl 和短型促凋亡蛋白Bcl-xs，其中Bcl-xl［33］为线粒体介导的细胞凋亡的关键调节因子，通过结合促凋亡的BAK，抑制线粒体外膜发生通透化（mitochondrial outer membrane permeab lisation，MOMP）、细胞色素C 等凋亡因子的释放来抑制BCR-ABL1 细胞凋亡，也可促进粒系-巨噬系祖细胞（granulocyte-macrophage progenitors，GMP）异常获得干细胞特性恶化为G0期的白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs），LSCs 可以积累额外的突变，使得细胞的耐药性进一步增强［34］。采用常规TKIs 处理K562 细胞，虽然导致大量的BCR-ABL+细胞死亡，但并不能有效清除LSCs。ABT-199靶向G0期LSCs，增加CML细胞对TKIs等药物的敏感性，对于CML 急变期的TKI 耐药患者，使用低至纳摩尔浓度的ABT-199 即可诱导CML 细胞凋亡，ABT-199和TKIs联合使用时，Bcl-xs上调，Bcl-xl下调，CML 小鼠生存期延长，抗白血病能力增强［35］。此外，研究已证明Bcl-2促凋亡家族BIM为IM介导的BCR-ABL 阳性白血病细胞凋亡的主要效应物之一，与各种抗凋亡Bcl-2家族成员结合并使之失活，加强BAX 和BAK 在膜间线粒体空间中的促凋亡作用［36］。有研究提示，BIM 中外显子3 的缺失多态性是除BCR-ABL1 激酶结构域突变外影响TKI 敏感性的其他突变［37］。

3.3 PKM2/PKM1

PKM 通过AS 编码包含外显子9 的PKM1 和包含外显子10 的PKM2，其中PKM1 和PKM2 分别与三羧酸循环和糖酵解相关。与正常细胞不同，肿瘤细胞即使在有氧环境中也倾向于糖酵解，而非三羧酸循环来代谢葡萄糖，该现象被称为Warburg 效应，此效应通过调节丙酮酸激酶PKM1 和PKM2 亚型的表达实现的。研究表明，定位在线粒体的PKM2可通过稳定Bcl-2 调节氧化应激诱导的细胞凋亡［38］。在CML中，BCR-ABL 通过mTOR/c-Myc/hnRNP/PKM 轴上调PKM2 的表达，导致自噬受损；IM 通过miR-124/PTBP1 信号级联促进PKM2 转化为PKM1，扰乱了Warburg 效应，代偿性激活线粒体脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）反应［39］，FAO 对LSCs 存在至关重要。Klawitter 等［40］利用核磁共振波谱法对IM敏感和耐药的CML 细胞株进行代谢分析发现，糖酵解活性升高与IM耐药有关。与IM敏感组比较，PKM2在IM耐药CML 细胞中高表达，且PKM2/PKM1 比值显著升高。高表达PKM2 促进CML 糖酵解，进而导致CML 耐药现象。研究表明，脂肪酸衍生物AIC-47 促进PKM2转化为PKM1，抑制肿瘤特异性糖酵解以及IM代偿激活的FAO 过程，并诱导CML 细胞发生自噬。与单独使用的AIC-47或IM相比，两者联合治疗对CML细胞杀灭作用更强［39］。

3.4 GSK3β

研究表明，LSCs的自更新及耐药的发生，均与在Wnt 通路中β-连环蛋白的异常激活有关，LSCs 的自更新则支持CML 进展为急变期［41］。正常状态下，β-连环蛋白由丝氨酸/苏氨酸激酶酪蛋白激酶Ⅰ（casein kinase Ⅰ，CKⅠ）和糖原合成酶-3（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）进行泛素化和降解。在CML中，GSK3β 异常剪接导致GMP 中WNT/β-连环蛋白通路的异常激活［42］。Abramsson等［43］进行cDNA测序分析显示，在急变期CML 祖细胞中，外显子8 和9 缺失导致的GSK3β 异常剪接异构体（m-GSK3β）的出现，阻止β-连环蛋白磷酸化，促进LSCs自更新，进而导致耐药的发生。在体外动物模型导入全长GSK3β，则CML 重建和侵袭能力下降［43］。与单独使用GSK3β 抑制剂锂或尼洛替尼相比，两者联合治疗则BCR-ABL 癌蛋白水平降低，自噬增加，该现象的发生可能与m-GSK3β表达下调有关［44］。

3.5 其他与CML耐药相关的剪接事件

上述研究均强调了异常pre-mRNA 剪接在CML发生和耐药中的关键作用，已经发现了许多CML 特异性剪接事件，包括但并不限于：BCR-ABL35INS［24］变体（外显子8、9 之间的部分内含子保留）导致编码与TKI 结合的激酶部分的蛋白提前终止；m-GSK3β［42］剪接异构体（缺失外显子8 和9）导致WNT/β-连环蛋白通路的异常激活，促进LSCs 的自更新；BIM-γ［27］缺失外显子4编码BH3结构域，该区域对于BIM的促细胞凋亡功能是必需的，采用BH3模拟药物治疗CML，可有效缓解BIM-γ 导致耐药；Bcl-2 家族成员［26］（Mcl-1、Bcl-x和BID）是介导细胞凋亡的关键调节因子，抑凋亡异构体的表达促进LSCs 存活和耐药的发生；CML 可以在氧化应激情况下通过定位在线粒体的PKM2［38］与Bcl-2之间的相互作用抑制细胞凋亡；IM 诱导的Gfi1b-sp2［29］剪接异构体（缺失外显子9编码锌指结构域）过表达可能导致费城染色体阴性CML 的出现；长型CD44R1［30］剪接异构体有助于LSCs黏附到基质细胞表面，从而抵御机体免疫攻击，促进LSCs自更新。基于外显子芯片的基因组学研究揭示了耐药CML 中广泛的异常剪接［23］，癌症基因组学研究的不断深入将为开发癌症精准医学的新型诊断和治疗策略奠定基础。

4 结论

TKI作为针对BCR-ABL的主要治疗药物现已广泛应用于临床，然而伴随出现的耐药也已成为其治疗的最主要障碍，尽管针对其耐药机制进行了长期研究，但耐药患者的疗效仍无明显改善。综上所述，部分关键基因的AS 对CML 耐药的发生具有重要意义。随着对CML耐药相关基因异常剪接认识的不断加深，以关键剪接体元件或特定CML 耐药相关基因剪接异构体作为治疗靶点，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。