先天性巨结肠肠壁神经组织免疫组织化学分析与检验学研究

孙 澜 邹 伟 刘晓华

（1 辽宁省辽阳市中心医院检验科，辽宁 辽阳 111000；2 辽宁省瓦房店市中心医院检验科，辽宁 瓦房店 116300）

先天性巨结肠（Hirsch sprung's disease，HD）是小儿外科的常见病，其病理特征是病变肠段黏膜下层及肌层间的神经节细胞缺如，神经纤维的广泛增生，但在新生儿、婴幼儿术后标本由于其神经节细胞本身发育往往不够成熟，在病理上易于与其他组织细胞相混淆。为此我们采用一组单抗及多抗试剂，对肠壁神经组织进行免疫酶标组织化学染色，以期能够找到一种特异性强、准确性高的诊断方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择本院2016年1月至2017年10月所保存的HD病理蜡块资料中随机选择20例，分别对其近端有神经节细胞段和远端无节细胞段进行研究。正常对照组标本取自3年病理尸检资料中相应肠壁组织学无异常改变者12例。第一抗体神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体，S-100蛋白抗体均为DAKO公司产品。ABC免疫酶标试剂盒购自华美生物工程公司上海分公司。

1.2 方法：采用ABC法进行免疫过氧化物酶法染色。切取4 μm厚度石蜡切片经37 ℃烘片1 h，二甲苯脱蜡，经过梯度洒清至蒸馏水洗，为阻断内源性过氧化物酶，用0.3%H2O2甲醇液室温下作用20 min，再经0.05%trypsin消化后加上2%正常马血清以降低背景的非特异性染色，倾去血清后加入第一抗体于湿盒内孵育1 h，经PBS洗3次后加入第二抗体（桥抗：biotin-抗兔或抗鼠IgG），室温下作用30 min后滴加入ABC试剂，最后DAB显色，甲基绿复染，中性树胶封片。

2 结 果

2.1 NSE染色：正常对照组12例及HD病例20例神经节细胞分布正常段肠壁的黏膜下层和肌层间神经丛中均见有细胞质内NSE染色阳性的神经节细胞，其细胞核周围的雪旺氏细胞为阴性染色，20例HD病例远端无节细胞段肠壁内不见NSE染色阳性的细胞，仅见神经纤维周围平滑肌细胞轻微的非特异性染色。

2.2 S-100蛋白染色：12例正常对照组及20例IID病例节细胞分布正常段肠壁神经丛中神经节细胞呈阴性染色，而周围的雪旺氏细胞为S-100蛋白阳性染色；在20例HD病变肠壁的神经丛中只见致密深染的神经纤维而无胞质淡染的神经节细胞存在。

3 讨 论

神经元特异性烯醇酶（Neuron Specific Enolase，NSE）来源于神经细胞及神经纤维，是一种糖酵介酶，用标记的抗NSE抗体于标本中的NSE结合，可清晰地显示肠黏膜下的神经组织[l-2]，如先天性巨结肠患儿在NSE免疫组化标记以后，可表现为无神经节细胞存在，而神经纤维大量增生[3-4]。S-100蛋白存在在神经元轴突的外围细胞—雪旺氏细胞内，同样用免疫组化的方法，可将标本中的S-100蛋白进行标记，在切片上清晰显示。在正常肠壁组织S-100蛋白染色可显示围绕神经节-圈的卫星细胞，中间神经节细胞不被染色而呈“空洞”，在先天性巨结肠“空洞”结构不存在，而显示大量增生的神经纤维[5-6]。因此采用免疫组化的方法一一多克隆抗体与神经组织特异结合，对于常规染色难于确定的患儿，具有很大的帮助[7-8]。本组12例正常对照组儿童标本神经节细胞质对NSE呈明显阳性反应，ABC作为显示剂结果为红色，并清楚地显示神经节细胞的形态及分布，与不着色的结缔组织细胞、平滑肌细胞径渭分明。对S-100蛋白12例正常对照组标本中的雪旺氏细胞呈阳性反应，在位于神经节周围的鞘细胞着色时，与阴性的神经节细胞形成明显对照。本组20例先天性巨结肠儿童狭窄段标本对NSE呈阴性反应，可明显确认没有神经元存在，S-100蛋白也不显示神经节细胞存在，并可显示增生、杂乱无章的神经纤维丛，这些神经纤维延伸至固有膜[9]。

上述研究结果表明，NSE免疫组化法大大提高了病理医师对本病黏膜下神经节细胞的鉴别能力，在很少几张切片就能显示结果，不需传统大量连续切片。S-100蛋白因能显示雪旺氏细胞，明显衬托出阴性的神经节细胞，二者结合起来，就不会把雪旺氏细胞、神经节细胞与结缔组织混淆起来，为诊断本病提供可靠的科学依据[10]。