HPLC法测定癌痛消方及其拆方中松脂醇二葡萄糖苷和芍药苷的含量

程金来 梁丹 夏猛 曹子茵 冷静

摘要：目的  建立癌痛消方及其拆方中松脂醇二葡萄糖苷和芍藥苷的测定方法。方法  采用十八烷基硅烷键合硅胶柱（Inertsil ODS-3柱 250×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85）为流动相，进行梯度洗脱;检测波长：230 nm（0～16 min，松脂醇二葡萄糖苷），277 nm（16～30 min，芍药苷）;流速：1.0 ml/min;柱温：30oC。结果  癌痛消-补虚组中松脂醇二葡萄糖苷在1.0～5.0 μg范围内呈现良好的线性关系，r=0.9992，平均回收率为97.23%（RSD=1.31%，n=6）;癌痛消-抑癌组中芍药苷在1.0～5.0 μg范围内呈现良好的线性关系，r=0.9993，平均回收率为97.08%（RSD=1.38%，n=6）;癌痛消-全方中松脂醇二葡萄糖苷在1.0～5.0 μg范围内呈现良好的线性关系，r=0.9992，平均回收率为98.01%（RSD=1.30%，n=6）;癌痛消-全方中芍药苷在1.0～5.0μg范围内呈现良好的线性关系，r=0.9993，平均回收率为96.97%（RSD=1.54%，n=6）;结论  本方法专属性强，准确度高，重现性良好，可用于癌痛消方的质量控制。

关键词：癌痛消方;含量测定;松脂醇二葡萄糖苷;芍药苷;HPLC

中图分类号：R286.0                                  文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.23.020

文章编号：1006-1959（2019）23-0073-05

Determination of Rosinol Diglucoside and Paeoniflorin in Cancer Painkiller and

Its Decomposed Formula by HPLC

CHENG Jin-Lai，LIANG Dan，XIA Meng，CAO Zi-Yin，LENG Jing

（Basic Medical College of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine/Guangxi Key Laboratory of Laboratory Animal Disease Models/Guangxi Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine and Translational Medicine

for High Infectious Diseases，Nanning 530200，Guangxi，China）

Abstract：Objective  To establish a method for the determination of rosinol diglucoside and paeoniflorin in Cancer Decoction and its decomposed formula. Methods  An octadecylsilane bonded silica gel column （Inertsil ODS-3 column 250×4.6 mm， 5 μm）; mobile phase： acetonitrile-0.1% phosphoric acid （15：85） as mobile phase， gradient elution; detection wavelength： 230 nm （0～16 min， rosinol diglucoside）， 277 nm （16～30 min， paeoniflorin）; flow rate： 1.0 ml/min; column temperature： 30oC. Results  In the cancer pain-compensation group， rosinol diglucoside showed a good linear relationship in the range of 1.0～5.0 μg， r=0.9992， and the average recovery was 97.23% （RSD=1.31%， n=6）;The paeoniflorin showed a good linear relationship in the range of 1.0～5.0 μg， r=0.9993， and the average recovery was 97.08% （RSD=1.38%， n=6）. Cancer pain elimination-total rosin Diglucoside showed a good linear relationship in the range of 1.0～5.0 μg， r=0.9992， the average recovery was 98.01% （RSD=1.30%， n=6）; The cancer has a good linear relationship in the range of 1.0～5.0μg， r=0.9993， and the average recovery rate is 96.97% （RSD=1.54%， n=6）. Conclusion  This method has strong specificity. High accuracy and good reproducibility， can be used for quality control of cancer pain.

Key words：Cancer pain elimination;Determination of content;Rosinol diglucoside;Paeoniflorin; HPLC

癌痛消方是广西中医药大学韦艾凌博士根据肝癌的发病特点并结合肝癌的现代研究成果，在经典方膈下逐瘀汤的基础上加味而成，具有活血化瘀、清热解毒、益气健脾、行气止痛的功效[1]。经广西中医药大学第一附属医院肿瘤科专家的指导后，将该方拆分成癌痛消方-补虚组、癌痛消方-抑癌组。本文在参考药典[2]后，采用高效液相色谱法（HPLC法）对癌痛消方-补虚组中的松脂醇二葡萄糖苷、癌痛消方-抑癌组中的芍药苷、癌痛消方-全方中的松脂醇二葡萄糖苷及芍药苷进行定量研究，现将结果报道如下。

1仪器与试药

1.1仪器  Agilnt1260型高效液相色谱仪;KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;GX-20型摇摆式中药粉碎机（上海荣舒工贸有限公司）;SHB-Ⅲ循水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;HH-8 数显恒温水浴锅（北京高信仪器设备有限公司）;调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）;YP50001电子天平（上海越平科学仪器有限公司）;SQP 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;RE52-99 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;TF881 数显鼓风干燥箱（吴江同丰烘箱电炉有限公司）;FYL-YS-50L恒温箱（北京福意联电器设备有限公司）。

1.2试药  松脂醇对照品（批号：180423）购于上海融禾医药科技有限公司;芍药苷对照品（批号：180420）购于上海融禾医药科技有限公司;乙腈为色谱纯;甲醇和磷酸为分析纯;水为自制重蒸水;其他试剂均为分析纯;癌痛消方所需中药材购自广西中医药大学第一附属医院，经广西中医药大学中药鉴定教研室廖月葵教授鉴定杜仲本品为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）的干燥树皮、赤芍为毛茛科植物芍药 （Paeonia lactiflora Pall）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根等。

2方法与结果

2.1色谱条件  色谱柱：Inertsil ODS-3柱（4.6×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，  V/V）为流动相，进行等度洗脱;流速：1.0 ml/min;柱温：30℃;进样量：10 μl;癌痛消-补虚组：检测波长：277 nm;理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于1000。癌痛消-抑癌组：检测波长：230 nm;理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。癌痛消-全方：检测波长：230 nm（0～16 min，松脂醇二葡萄糖苷），277 nm（16～30 min，芍药苷）;理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于1000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备  ①癌痛消-补虚组：松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液的制备：取松脂醇二葡萄  糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l ml含0.5 mg的溶液，即得。②癌痛消-抑癌组：芍药苷对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定后，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含芍药苷0.5 mg的溶液，即得。③癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液的制备：取松脂醇二葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即得;芍药苷对照品溶液的制备：首先取芍药苷对照品适量，精密称定后，置于棕色量瓶中，再加甲醇制成每1 ml含芍药苷20 μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备  ①癌痛消-补虚组：按处方量精密称取4味中药材饮片，加入10倍量的水，加热提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液，定容备用，取滤液2 ml进行3000 r/min离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。②癌痛消-抑癌组：按处方量精密称取7味中药材饮片，加入8倍量的80%乙醇，加热回流提取2次，  每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液，定容   备用，取滤液2 ml进行3000 r/min离心10min，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。③癌痛消-全方：按处方量精密称取补虚扶正组4味中药材饮片，加入10倍量的水，加热回流提取2次，每次提取    1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液;在药渣中按处方量精密称取抑癌组7味中药材饮片，加入8倍量的80%乙醇，加热回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液。合并水提取液与80%乙醇提取液，定容备用，取滤液2 ml进行3000 r/min离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.2.3阴性供试品溶液的制备  ①癌痛消-补虚组：按处方量精密称取除杜仲以外的3味中药材饮片，加入10倍量的水，加熱提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液，定容备用，取滤液2 ml进行3000 r/min离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，即得。②癌痛消-抑癌组：按处方量精密称取除芍药以外的6味中药材饮片，加入8倍量的80%乙醇，加热回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次     滤液，定容备用，取滤液2 ml进行3000 r/min离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，即得。③癌痛消-全方：按处方量精密称取补虚扶正组取除杜仲以外的3味中药材饮片，加入10倍量的水，加热回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液;在药渣中按处方量精密称取抑癌组除芍药以外的6味中药材饮片，加入8倍量的80%乙醇，加热回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液。合并水提取液与80%乙醇提取液，定容备用，取滤液2 ml进行3000 r/min离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3方法学考察

2.3.1阴性干扰试验  取“2.2”项下3种溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行分析测定，分别测定其峰面积。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱图保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，分离度均>1.5，并且阴性供试品无干扰峰出现。①癌痛消-补虚组：理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算均不低于1000，表明阴性样品中其他组分对松脂醇的测定无干扰，见图1。②癌痛消-抑癌组：理论板数按芍药苷峰计算均不低于3000，表明阴性样品中其他组分对芍药苷的测定无干扰，见图2。③癌痛消-全方：理论板数按理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算均不低于1000，表明阴性样品中其他组分对松脂醇、芍药苷的测定无干扰，见图3。

2.3.2线性关系考察  精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 μl进样测定峰面积，按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，分别测定峰面积。以对照品的进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得其回归方程。癌痛消-补虚组：松脂醇二葡萄糖苷回归方程y=1269.6x+2071.4，相关系数r=0.9992;癌痛消-抑癌组：芍药苷回归方程y=2425.3x+264.76，相关系数r=0.9993;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷回归方程y=1269.6x+2071.4，相关系数r=0.9992;芍药苷回归方程y=2425.3x+264.76，相关系数r=0.9993。试验结果表明，松脂醇二葡萄糖苷进样量在1.0～5.0 μg，芍药苷进样量在1.0～5.0 μg，与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3精密度考察  精密的吸取同一对照品溶液    10 μl，按“2.1”项下色谱条件进行分析检测，连续进样6次，记录其色谱峰的峰面积，计算结果。癌痛消-补虚组：松脂醇二葡萄糖苷 RSD为0.89%;癌痛消-抑癌组：芍药苷RSD为0.34%;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷RSD为0.89%、芍药苷RSD为0.34%，试验结果均显示仪器精密度良好。

2.3.4重复性考察  按“2.2.2”项下“供试品溶液的制备”方法分别制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下，精密吸取10 μl进样分析。测定癌痛消-补虚组：松脂醇二葡萄糖苷的含量，其RSD分别为1.30%;癌痛消-抑癌组：芍药苷的含量，其RSD分别为0.16%;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷、芍药苷的含量，其RSD分别为1.61%、2.54%，结果均显示该方法重复性良好。

2.3.5稳定性试验  取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取10 μl进样分析，按“2.1”项下色谱条件。测定癌痛消-补虚组：松脂醇二葡萄糖苷的峰面积，其RSD为2.03%;癌痛消-抑癌组：芍药苷的峰面积，其RSD为0.15%;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷、芍药苷的峰面积，其RSD分别为0.51%、0.44%。结果均显示供试品稳定性良好。

2.3.6加样回收试验  精密量取已知松脂醇二葡萄糖苷或芍药苷含量的供试品溶液，每个方子6份，共18份。分别加入一定量的松脂醇二葡萄糖苷或芍药苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算加样的回收率，见表1。

2.4样品含量测定  按处方量分别精密称取3份、3份、11份上述味药材饮片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析后，计算松脂醇二葡萄糖苷、芍药苷的含量，见表2。

3讨论

肝癌为多发疾病，其病因是机体在内外因素的作用下，机体气机不畅，阴阳失衡，脏腑亏虚，气血不畅，机体正气虚衰日久，痰、浊、毒、淤等病理产物互结，凝结日久，形成肝癌。据此，以祛邪扶正的治则，清、消、补三法合用，在膈下逐淤汤方的基础上，加减成为癌痛消方[3]。其全方组成：黄芪30 g、杜仲20 g、党参10 g、炙甘草10 g、莪术10 g、三棱10 g、桃仁10 g、赤芍30 g、鳖甲20 g、龟板20 g、牡蛎20 g。经广西中医药大学第一附属医院肿瘤科专家的指导后，将该方拆分成癌痛消方（补虚组）、癌痛消方（抑癌组）。癌痛消方（补虚组）组成：黄芪30 g、杜仲  20 g、党参10 g、炙甘草10 g;癌痛消方（抑癌组）组成：莪术10 g、三棱10 g、桃仁10 g、赤芍30 g、鳖甲20 g、龟板20 g、牡蛎20 g。

综上所述，经高效液相色谱法（HPLC法）后，测得结果比较理想，本法专属性强，操作方便，准确度高，重现性良好，可以用于癌痛消方及其拆方的质量控制。

参考文献：

[1]农毅清，蒋林，谭安蔷.癌痛消颗粒质量标准研究[J].中国药师，2014（11）：1859-1861.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：105.

[3]胥冰，黄峰，韦艾凌，等.癌痛消方对DEN诱癌大鼠不同时间点凋亡相关蛋白的影响[J].华西药学杂志，2017，32（5）：489-492.

收稿日期：2019-9-17;修回日期：2019-9-30

編辑/肖婷婷