食品中黄曲霉毒素检测技术的研究进展

史春悦

（天津市南开区教育后勤服务中心，天津 300190）

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs） 主要是由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉 （Aspergillus paraciticus）产生的次级代谢产物[1]。这类真菌在自然界中，尤其是在高温高湿的热带和亚热带地区分布广泛、污染范围广，谷物、豆类、坚果、油脂、调味品、乳制品等易受其污染[2]。

已知的黄曲霉毒素有20多种，在自然条件下产生的黄曲霉毒素主要包括AFB1，AFB2，AFG1和AFG2[3]。根据其在紫外照射下产生的荧光颜色不同，主要分为黄曲霉毒素B（Blue） 与黄曲霉毒素G（Green）。B族黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1（AFB1）和黄曲霉毒素B2（AFB2），在紫外照射下呈现蓝色荧光，主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生；G族黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素G1（AFG1）和黄曲霉毒素G2（AFG2），在紫外照射下呈现绿色荧光，主要由黄曲霉菌产生[4-5]。AFM1由AFB1通过体内代谢产生，泌乳动物食用受AFB1污染的食物或饲料后由乳汁或尿液进行分泌[6]。

黄曲霉毒素具有强致癌性和毒性，世界卫生组织的癌症研究机构已将其列为I类致癌物。黄曲霉毒素结构类似物的基本结构均有1个氧杂萘邻酮（香豆素）和1个双呋喃环，致癌性主要与香豆素结构有关，毒性主要与二呋喃环结构有关，其中以AFB1最为常见且毒性最强。我国GB/T 2761—2017国家标准规定了食品中真菌毒素的限量，分别规定了谷物、豆类、坚果及其制品等产品中AFB1的限量，限量为0.5～20.0 μg/kg，规定乳及乳制品中 AFM1的限量为0.5 μg/kg。我国 GB/T 5009.22—2016国家标准规定了食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定方法，主要包括同位素稀释液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-柱前衍生法、高效液相色谱-柱后衍生法、酶联免疫吸附筛查法、薄层色谱法。目前，用于检测黄曲霉毒素含量的技术基于原理不同，大体上可以分为基于色谱分离、荧光检测或质谱检测原理的大型仪器检测技术和基于免疫学原理的快速检测技术[7]。

1 仪器分析法

用于黄曲霉毒素检测的仪器法分析法主要包括高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、超高效液相色谱法（Ultra HP-LC，UHPLC）、液相色谱与质谱联用法（HPLC-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）、气相色谱与质谱联用法（GC-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS） 等。

通常使用紫外或荧光检测器配合HPLC进行检测。Campos W E O 等人[8]对坚果中 AFB1，AFB2，AFG1和AFG2进行检测，样品经甲醇提取、免疫亲和柱净化、高效液相色谱荧光检测及柱后衍生化进行定量检测。Fu Z等人[9]利用UHPLC-UV法对玉米和花生中的黄曲霉毒素，对AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的最低检出限分别为0.32，0.19，0.32，0.19 μg/kg。

液相或气相色谱与质谱联用适用于对同一样本中多种待测物质同时进行定量检测，具有较高的灵敏度。Lattanzio V M T等人[10]利用HPLC-MS/MS对谷物中包括AFB1，AFB2，AFG1和AFG2在内的多种真菌毒素同时进行定量检测。Vaclavik L等人[11]利用UHPLC-MS/MS对咖啡豆中34种真菌毒素同时检测。

仪器分析法灵敏度高，能够进行精确的定量检测，可进行自动进样，从而实现自动化检测，但由于存在样本前处理复杂、试验仪器昂贵等问题，难以对大量样本进行快速检测。

2 免疫学检测方法

免疫学检测方法基于抗原抗体的特异性反应，检测结果可以通过视觉判断或者酶标仪读数，能够对真菌毒素进行定性或定量检测。该方法具有高特异性、高灵敏性、便于携带、操作简单等特点，可以用于真菌毒素的现场快速检测。

2.1 酶联免疫分析方法

酶联免疫分析方法（ELISA）的原理基于抗体、抗原之间的特异性反应及酶的高效催化作用。由于真菌毒素属于小分子半抗原，通常采用竞争反应模式。用于标记的酶通常是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶[12]。竞争法分为直接竞争法和间接竞争法。Lawellin D W等人[13]通过采用辣根过氧化物酶来标记AFB1半抗原，利用直接竞争ELISA法对玉米中AFB1进行检测，检出限为10 pg/mL。Zhang Q[14]利用间接竞争ELISA法，对检测乳制品中AFM1进行检测，检出限达3 ng/L，回收率为91%～110%。Li P等人[15]利用单克隆抗体10C9建立的ELISA方法，对花生中黄曲霉毒素总量进行检测，回收率为87.5%～102.0%，能够实现花生样品中黄曲霉总量的快速检测。

ELISA检测方法简单易操作，具有高特异、高灵敏等特性，可对批量样本中的黄曲霉毒素进行快速检测，在农产品食品安全检测领域已有广泛应用。但在实际检测中可能会出现重复性差、假阳性率高等情况，样品中的氧化酶、蛋白酶等也可能会对检测结果造成影响。

2.2 免疫亲和检测技术

免疫亲和技术 （Immunoaffinity Column，IAC）的原理基于免疫化学反应，通过对待测物质进行净化和浓缩，去除样品基质干扰，采用高效液相色谱仪、荧光分光光度仪或ELISA进行检测，可以提高检 测灵敏度和准确度。免疫亲和柱联合色谱分析法（IAC-HPLC）将免疫分析方法的快捷、特异性与仪器分析方法的精确性等优点结合起来，比传统的HPLC更稳定、可靠，目前已成为黄曲霉毒素定量检测的重要方法。Fei Ma等人[16]利用单克隆抗体1C11制备出免疫亲和柱，利用IAC-HPLC法检测花生、植物油和茶叶中的黄曲霉毒素含量，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的检出限分别为 0.25，0.30，0.10，0.18 μg/kg。

2.3 免疫层析法

免疫层析法的原理是将抗原或抗体包被于固相载体硝酸纤维膜上，检测时将样品加到试纸上的样品垫，样品在毛细管作用下前移与标记探针相互作用形成复合物，可通过肉眼或对借助信号采集仪器对显色结果进行定性或定量分析。免疫层析试纸条的组分包括样品垫、标记探针固定垫、硝酸纤维膜（NC膜）、吸水垫和底板。

基于胶体金标记的免疫层析技术（GNP-ICA）将胶体金标记技术、免疫分析技术和层析技术联系起来。宋青龙等人[17]利用该方法研制出一种胶体金快速定量检测试剂盒，用于谷物和饲料中黄曲霉毒素B1的检测，检测结果与HPLC检测结果相符。

免疫层析法具有快捷、灵敏、特异的特点，结果判断直观可靠、成本低廉、操作简单、不依靠大型仪器设备和专业技术人员，在现场监控和大规模样品检测中取得了广泛应用。

2.4 荧光免疫法

荧光免疫法采用荧光标记取代酶联免疫检测法中的酶标记，通过检测荧光信号对结果进行测定，具有较高的灵敏度，可实现对微量或超微量样品的检测。常用的荧光免疫分析法主要包括荧光免疫分析（Immuno-fluoremetrie Assays，IFMA）、荧光偏振免疫分析 （Fluorescence Polarization Immunoassay，FPIA）、荧光激发共振能量转移免疫分析（Fluorescence Resonance Energy Transfer Immunoassay，FRETIA）、时间分辨荧光免疫分析（Time Resolved Fluorescence Immunoassay，TRFIA） 和多组分免疫分析（Multianalyte Immunoassay，MAIA）。

IFMA的原理类似于ELISA，检测时根据荧光信号的强度对待检物质的含量进行定性或定量分析。常用的荧光标记物为异硫氰酸荧光素。Zhang Z等人[18]利用基于量子荧光的IFMA法对花生中的AFB1进行检测，检出限为0.016 ng/mL。

FPIA的原理基于抗原抗体结合物荧光偏振程度的差异，偏振荧光强度与检测物质的量呈反比。Beloglazova N V等人[19]利用FPIA法对啤酒中AFB1进行检测，检出限为1 ng/mL。

FRETIA的原理基于2个不同荧光基团之间能量的相互转移。其中，转移能量的荧光基团为供体，当 2个荧光基团足够靠近时，通过电偶极作用供体分子和受体分子之间发生能量共振转移。Hui L等人[20]利用基于荧光激发共振能量转移原理的装置，实现了牛奶中AFM1的检测。

TRFIA通常以镧系稀有金属离子及其螯合剂作为荧光标记物。利用时间分辨荧光检测仪检测待测物质的荧光强度，根据荧光信号的强度确定待检物质的含量。Tang X等人[21]利用TRFIA对牛奶中AFM1进行检测，检出限为0.03 ng/mL，检测时间只需6 min，与用同样抗体制作的胶体金试纸条相比灵敏度提高了10倍，与HPLC相比结果一致。

MAIA通常采用光谱不重叠的多标记物，实现样本中多指标或不同成分的同时检测。Kanungo L等人[22]利用该方法对黄曲霉毒素进行检测。

2.5 化学发光免疫法

化学发光免疫法（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA），以化学发光剂直接标记抗原或抗体，利用化学发光检测仪检测待测物质的信号强度，根据信号的强度确定待检物质的含量。根据标记物的不同，可将其分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。

化学发光免疫分析法的原理是通过鲁米诺或吖啶酯类等试剂直接标记抗体或抗原，与待测物质发生特异性反应。裘雪梅等人[23]采用吖啶酯标记AFB1，利用竞争性化学发光免疫分析法对黍米样品中AFB1进行检测。化学发光酶免疫分析法的原理是基于酶联反应，通过加入化学发光底物实现信号的检测。王岩等人[24]利用于化学发光酶免疫分析法检测乳制品中AFM1的含量。电化学发光免疫分析法的原理是以电化学发光剂直接标记抗原或抗体，标记后的抗原或抗体与待测物质中的抗体或抗原结合，形成的复合物在电场作用下发生电化学发光反应，根据发光强度确定待检物质的含量。汪玉等人[25]利用该原理研制了一种基于磁性纳米纤维/碳纳米角修饰的电化学发光免疫传感器用于黄曲霉毒素的检测。

CLIA与ELISA法相比，具有更高的灵敏度，可用于痕量样品的检测。此外，该方法具有特异性强、线性范围宽、仪器操作简单、成本低廉等特点，适合大批量样本的检测。

2.6 免疫传感器法

免疫传感器法基于免疫学反应与传感器技术，通过抗体的选择性检测待检物质，同时能够将检测的结果转换成相应数据形式的转换信号。根据传感技术原理的不同，可分为电化学免疫传感器、质量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器和光学免疫传感器。运用该方法进行检测只需少量样品可获得多种目标物的检测结果，检测限可达pg-ng级水平，并且重复性好、特异性强、自动化程度高，适用于黄曲霉毒素和其他真菌毒素的混合污染检测。

2.7 免疫芯片检测法

免疫芯片又称抗体芯片，基于抗原抗体间的特异性反应，芯片上设置有探针点阵，通过特异性反应捕获待测样本中的靶向蛋白质，然后通过激光图谱扫描进行图像成像，然后在计算机计算的同时，对结果进行分析，而且可对大量样本中多种物质进行同时定性或定量分析，分为固相和液相2种模式。免疫芯片技术可用于样本中包括黄曲霉毒素在内的多种真菌毒素进行同步检测，具有操作方便、灵敏度高、分析速度快、选择性强等特点。

3 结语

黄曲霉毒素在一定的湿度和温度条件下，容易引起食品霉变，对人体健康造成威胁。因此，从源头发现控制黄曲霉毒素的危害，加强对食品中黄曲霉毒素的检测研究十分必要。仪器分析法灵敏度高，能够进行精确的定量检测，但存在样本前处理复杂、对仪器和操作人员的要求较高、难以对大量样本进行快速检测等问题。免疫学检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的特点，适用于现场快速检测。今后，为实现更方便快捷、高通量、现场检测的要求，还应在将免疫原理与现代分析技术相结合研究开发新型食品安全快速检测技术方面努力。