鸡法氏囊和腺病毒精制卵黄抗体制备与应用

吴卫东 魏中锋 徐梅 蔡文利

（1，山东省菏泽市食品药品检验检测研究院 274000；2，山东省菏泽市动物疫病预防控制中心 2740001）

鸡法氏囊病（IBD）是一种急性、高度传染性可引起免疫抑制性的鸡的烈性传染病[1]。近几年，鸡法氏囊和腺病毒对目前鸡养殖业已造成重大危害，尤其在有些地区还存在禽法氏囊和腺病毒混合感染的情况。本试验用从当地分离的鸡法氏囊和腺病毒流行株病毒制备成二联油佐剂灭活疫苗后，经过对150日龄的蛋鸡进行3 次免疫后，制备出抗鸡法氏囊和腺病毒二联精制卵黄抗体，有望对当地鸡法氏囊和腺病毒疫情进行有效控制。

1 材料

1.1 毒株及疫苗

毒株为由本实验室分离鉴定的当地流行株，疫苗为本实验室制备的鸡法氏囊和腺病毒二联灭活油乳剂疫苗。

1.2 试验鸡

卵黄抗体鸡有本地某种蛋鸡养殖场提供150日龄产蛋鸡50只，SPF 鸡购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3 试验主要仪器

电子天平购自日本岛津 (Shimadzu) 公司、高速冷冻离心机购自德国SIGMA/西格玛公司。

1.4 试验试剂

法氏囊琼扩标准抗原、法氏囊琼扩标准阳性血清，鸡腺病毒I 亚群IV 型琼扩标准抗原与标准阳性血清，购江苏农科院家禽研究所。聚乙二醇6000 购自江苏省海安石油化工厂。

2 方法

2.1 产蛋鸡免疫

对试验产蛋鸡每只鸡颈部皮下注射鸡法氏囊和腺病毒二联灭活疫苗0.5ml/只，2 周后加强免疫胸部肌肉注射灭活疫苗0.5ml/只，在第4 周后进行最后一次加强免疫颈部皮下和腿部肌肉各注射灭活疫苗0.5ml/只。

2.2 免疫鸡抗体效价监测

在产蛋鸡免疫后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 个月、3 个月、4 个月、6 个月时分别对所有免疫鸡翅静脉采血1.0ml，分离血清。采用琼脂扩散方法分别测定鸡法氏囊和腺病毒抗体效价。

2.3 卵黄抗体的提取

参考Ismeal Marcet 等[2]中的方法进行卵黄抗体提取，在产蛋鸡注射疫苗后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 个月、3 个月、4个月、6 个月时采集免疫蛋鸡鸡蛋，用清水将鸡蛋外部清洗干净，对鸡蛋壳表面用75%酒精消毒处理，敲开蛋壳，用卵黄分离器分离蛋黄，挑破卵黄膜，无菌收取卵黄液，充分混匀。将收取的卵黄液和 pH7.6，0.1M 的 Tris．HCI 缓冲液按 1:2 充分混匀，加入 PEG6000 粉搅拌，使 PEG6000 最终浓度为 3.5% (W/V)，匀速搅拌使 PEG6000 完全融化，室温孵化 30min。用高速冷冻离心机 4℃、8000prm 离心 20min，然后用 0.45gm 微孔滤膜过滤，向上清液中加PEG6000 至终浓度为12%获取沉淀，用定量PBS 溶液溶解沉淀即为精制卵黄抗体溶液。

2.4 卵黄抗体监测

在试验蛋鸡注射疫苗后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 个月、3 个月、4 个月、6 个月后分别提取卵黄中的抗体，采用琼脂扩散试验方法分别测定鸡法氏囊和腺病毒卵黄抗体效价。

2.5 卵黄抗体质量检测

按照兽药典中的规定方法进行无菌检验、安全性检验、抗体效价检测等常规检验。

2.6 临床应用试验

购买 90 只 21日龄的 SPF 鸡，每组 30 只，分为对照组、免疫组、治疗组，对照组每只鸡皮下注射灭菌生理盐水0.5ml，注射后3d，所有鸡点眼接种法氏囊强毒和肌肉注射腺病毒强毒，接种量为 0.1ml/只，免疫组每只鸡肌肉注射卵黄抗体0.5ml，3d 后，再接种法氏囊和腺病毒强毒，治疗组接种法氏囊和腺病毒病毒液0.1ml/只，待鸡出现临床症状后立即腿部肌肉注射卵黄抗体0.5ml/只，3 组鸡隔离饲养，专人饲喂，每日记录每只鸡的临床症表现和发病死亡情况，对死亡的鸡解剖检验，记录病理变化。

3 结果

3.1 产蛋鸡免疫抗体结果

在疫苗免疫后，免疫组蛋鸡血清抗体效价逐渐提高，在首免2 周后即法氏囊和腺病毒抗体效价分别为3.8log2 和4.2log2，至首次免疫后2 个月后抗体效价达到峰值8.1log2 和8.6log2，随后开始维持在一定水平，至免疫后6 个月，法氏囊和腺病毒的抗体效价仍维持在7.3log2 和7.5log2 以上。

3.2 卵黄抗体监测结果

在疫苗免疫后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 个月、3 个月、4个月、6 个月监测提取的卵黄抗体中的法氏囊和腺病毒抗体效价，在首免3 周后，免疫组蛋鸡卵黄中法氏囊和腺病毒的抗体效价逐渐提高，至首次免疫后3 个月抗体效价达到峰值8.6log2和8.7log2，随后开始维持在一定水平，至免疫后6 个月，法氏囊和腺病毒抗体效价仍维持在7.4log2 和7.6log2 以上。经检测，免疫蛋鸡的血清抗体上升规律与卵黄抗体基本一致，但卵黄抗体的增长趋势较血清抗体推迟5～7d，开始时卵黄抗体效价低于血清抗体效价，这可能是血清中抗体来源于血清，而逐步转移至卵黄需要一段时间。

3.3 免卵黄抗体的质量检验

3.3.1 无菌检验结果

取高免卵黄抗体0.2ml，分别接种于鲜血琼脂平板、马丁肉汤和厌气肉肝汤培养基，37℃培养72h，均未发现有细菌生长。

3.3.2 卵黄抗体安全性试验

将制备好的卵黄抗体注射21日龄健康SPF 鸡10 只，每只鸡颈部皮下注射卵黄抗体3ml，观察14d，未发现接种鸡死亡和接种部位有不良反应发生。

3.4 临床试验结果

对照组鸡在用法氏囊和腺病毒液攻毒后出现发热、精神萎靡、拉黄绿粪便等临床症状，7d 后所有对照组鸡全部死亡，解剖可见心包大量积液、肝脏肿大淤血、腺胃乳头肿大出血、法氏囊出血、腿部胸部肌肉出血等法氏囊和腺病毒感染的典型病理变化。

免疫组在注射卵黄抗体3日后攻毒，在14d 内只有1 只鸡死亡，其余鸡未表现出食欲减退、精神萎靡等临床表现，将免疫组鸡宰杀、解剖后，内脏器官未见任何病理变化，表明接种卵黄抗体0.5ml 的免疫组在免疫3d 后能完全抵抗法氏囊和腺病毒强毒株的攻击，卵黄抗体预防法氏囊和腺病毒的效果较好，预防保护率达96.7%。

治疗组在攻毒后4d 后出现临床症状时及时注射卵黄抗体进行治疗，在3d 后绝大多数鸡精神恢复正常，在14d 内只有两只鸡死亡，其余未死亡。本试验表明，制备的卵黄抗体对法氏囊和腺病毒强毒株感染具有显著的治疗效果，治愈率达93.3%。

4 讨论与小结

本试验利用本地分离鉴定的法氏囊和腺病毒流行株制备疫苗，在通过多次免疫产蛋鸡，利用PEG6000 提取和微孔滤膜过滤获得精制卵黄抗体，试验结果显示，制备的鸡法氏囊和腺病毒二联卵黄抗体对强毒感染的预防保护率为96.7%，治愈率为93.3%。对本地区法氏囊和腺病毒疫病的流行控制有极其重要的意义，尤其对一些肉鸡养殖场经常发生法氏囊和腺病毒混合感染可起到有效控制[2]。