水产动物肠道微生物的研究方法

2019-01-06郭倩倩胡军娜魏金锁

河南水产 2019年1期

郭倩倩，胡军娜，魏金锁，张航

（1漯河市水产技术推广站，河南漯河462000；2漯河市源汇区农林局，河南漯河462000；3漯河市植物保护植物检疫站，河南漯河462000）

肠道微生物组成了生物个体内部数量巨大且复杂的生态系统，其组成及活性的变化与相关环境因素、宿主协同发展，与宿主相关基因组、营养吸收、代谢活动、生活方法形成了复杂的相互作用关系[1]。鱼类体内的肠道微生物在保持肠道健康、促使肠道发育、抵御病原入侵、改善机体能量吸收和脂肪代谢过程中起到了非常重要的作用。

本文就肠道微生物的影响因素、研究方法、尤其是目前最新最广泛应用的方法等作了综述，以期为肠道微生物对鱼类的影响，及其在水产养殖生产中的应用提供全面的理论知识和应用信息。

1 影响水产动物肠道微生物的因素

1.1 物种因素

多数研究表明，水产动物肠道微生物主要包括需氧微生物、兼性厌氧微生物和专性厌氧微生物。细菌是鱼类肠道微生物最主要的种类。不同鱼类肠道微生物的种类和比例不同。在一些鱼类的肠道中，革兰氏阴性细菌的数量居多，革兰氏阳性细菌的数量较少。在海水鱼类的肠道中，无色杆菌属（Achromobacter）、微球菌属（Micrococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、交替单胞菌属（Alteromonas）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、黄杆菌属（Flavobacterium）为主要的细菌类型[2]。在淡水鱼类的肠道中，假单胞杆菌属（Pseudomonas）、拟杆菌属A型（Bacteroidestype A）、气单胞菌属（Aeromonas）是首要的细菌类型。除此之外，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、梭状杆菌属（Clostridium）、微球菌属（Micrococcus）、邻单胞菌属（Plesiomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、镰孢菌属（Fusarium）和拟杆菌属B型（Bacteroidestype B）在淡水鱼类的肠道中也存在。此外，乳酸菌在淡水鱼类和海水鱼类肠道中均有发现。某些酵母菌也在鱼类肠道中广泛存在。在淡水鱼类和海水鱼类中均能发现红酵母属（Rhodotorula）中的酵母菌，并且发现的频率较高。在海水鱼类中，皮状丝孢酵母（Trichosporoncutaneum）、假丝酵母菌（Candida tropicalisare）、梅奇酵母菌（Metschnikowiazobelii）是肠道酵母菌中的优势类群。

1.2 生理因素

鱼类在生长发育的各种阶段，其体内肠道微生物的群落构成比例及数量都不相同。在对欧洲鳎（Soleasolea）的研究发现，处在仔鱼期的欧洲鳎肠道微生物以产碱杆菌属（Alcaligenes）、假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、莫拉克氏菌属（Moraxella）、非产气单胞菌属（Anaerogenicaeromonas）为主，但在稚鱼期和成鱼期则主要以黄杆菌属（Flavobacterium）、莫拉克氏菌属（Moraxella）、发光细菌（Photobacterium）、产碱杆菌（Alcaligenes）、葡萄球菌（Staphylococcus）、微非产气单胞菌属（Anaerogenicaeromonas）、弧菌属（Vibrio）、球菌（Micrococcus）为主。Verner-Jeffreys等对大西洋大比目鱼（Hippoglossus hippoglossus）的研究也有相似的报道[2]。

1.3 环境因素

众所周知，水体中含有大量的微生物，而鱼类生活在水环境中。从仔鱼孵化开始，微生物便以不同形式由水体进入肠道，其中适应肠道内环境的微生物便演变为肠道中的常驻菌群。环境中的众多因子影响鱼类肠道微生物的组成和数量。季节的变化会引起鱼类肠道微生物的变化。在对奥尼罗非鱼（Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus）肠道中细菌含量测定的研究中发现，在夏、秋、冬三个季节中肠道内细菌数量的变化较大。水温的高低也会影响鱼类肠道微生物结构组成[3]。Leamaster等[4]在红罗非鱼（Oreochromismossambicus）的研究中发现，水体温度在18℃时，其肠道微生物的数量明显多于26℃时。此外，水体中残留的杀虫剂、农药、抗生素等也会影响鱼类肠道微生物菌群。

1.4 营养与饲料因素

饲料是促进鱼类生长的最直接营养，它的组成成分会影响鱼类肠道微生物的组成。研究表明，在仔鱼阶段、稚鱼阶段和幼鱼阶段，鱼类体内的肠道微生物菌群会根据饲料组成物质和营养成分的改变发生相对较快的变化。饲料中添加相应的添加剂（如益生菌或益生元等），将会对调节肠道微生态的平衡状态，改善肠道菌群构成比例产生积极的作用。Ringφ等[5]研究表明，饲喂标准大豆蛋白和发酵大豆蛋白的大西洋鳕鱼，鱼体肠道中细菌以嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和肉杆菌属（Carnobacterium）为主。而如果饲喂鱼粉，鱼体肠道中细菌则以肉杆菌属（Carnobacterium）和环丝菌属（Brochothrix）为主。

2 肠道微生物的研究方法

2.1 纯培养方法

早期对人类肠道微生物的研究主要基于纯培养研究方法，研究者通过模拟肠道内厌氧环境，利用纯培养技术，以粪便、肠粘膜或者肠道内容物为研究对象，对肠道中的微生物类群进行定性定量分析鉴定。由于肠道内存在的细菌种类较多，肠道内环境中包含的营养物质较为丰富，且需严格厌氧条件，因此，用纯培养方法来定性定量检测肠道微生物菌群具有局限性，但获得的纯培养微生物对于帮助我们了解肠道微生物的结构和功能意义重大。通过分离培养获得肠道中微生物的纯培养物，不仅有助于帮助我们研究肠道微生物在不同生长条件下的基因表达情况和代谢产物变化情况，更有助于帮助我们了解肠道微生物间的相互作用。此外，肠道微生物纯培养还能够为我们深入阐明致病菌的致病机理奠定基础。

随着分子生物学的发展，目前创建了“序列引导”分离方法，即首先利用分子技术对肠道菌群组成进行分析，之后根据分析结果选择分离特定物种，通过基因组测序等方法，有针对性地对照分析肠道菌群与某些生理状态相对应的功能。

2.2 依赖指纹图谱的分子生态学研究方法

基于纯培养的微生物菌落结构分析方法不能全面了解肠道菌群的组成结构、功能和多样性。因为机体肠道内严格的厌氧环境很难模拟，加上某些微生物需要的营养物质较为特殊，绝大多数的肠道微生物菌株不能通过纯培养方法分离得到。近几年来，分子生态学发展迅速，与传统的纯培养方法不同，微生物分子生态学方法是针对群落当中所有DNA物质进行分析，能够较为全面地分析样品中微生物群落组成和功能的多样性。该方法无需进行纯培养分离，速度相对较快，结果也较为客观。

在微生物分子技术分析中，最为广泛的分子标记物是核糖体小亚基RNA基因（16S rRNA或18S rRNA基因）。在微生物分子生态学应用中，主要用于微生物群落组成结构及物种多样性分析，并对菌群功能进行预测。除此之外，利用特异性引物分析功能基因也是常用的方法。微生物分子生态学常用的技术主要有指纹图谱技术和基于测序的技术。

指纹图谱技术是通过PCR扩增获得代表微生物群落的总体核酸分子，通过不同形式的凝胶电泳，分离不同核酸分子。该技术可以快速直观地展现样本中微生物群落的概况，适合同一样本的动态监测和不同样本间的横向比较。当前应用较为广泛的指纹图谱技术主要包含了变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）和ERIC-PCR指纹图谱。变性/温度梯度凝胶电泳技术（DGGE/TGGE），是指扩增的片段长度一致但序列各异的双链DNA分子在发生解链的变化过程中，所需的温度或变性剂梯度不同。在电泳时，序列不一致的DNA会在迁移到不同的位置时发生解链，从而使不同序列的DNA分子在电泳过程中分开。Muyzer等首次利用变性梯度凝胶电泳研究微生物群落结构的多样性[6]。之后，研究学者将该技术应用到人体肠道微生物菌群结构的研究中[7]。随后，张学礼等人对该技术进行了优化，他们通过利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳去除由于PCR不完全造成的单链DNA污染，以此来提高变性/温度梯度凝胶电泳图谱的种类及对条带回收测序的准确性[8]。末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）是通过限制性酶切特定片断后，在片段末端加上荧光标记来区别不同物种的一种方法。该技术被广泛应用于土壤、水体、肠道菌群等复杂的环境微生物群落研究中。此外，PCR-ERIC指纹图谱技术被应用于环境微生物群落结构的分析中。研究表明，针对不同的细菌类型，ERIC序列具有不同的数量以及长度，甚至在有的DNA中不需要ERIC序列的存在，使用ERIC-PCR引物也能够进行PCR扩增，进而得到相对稳定的指纹图谱。鉴于该方法相对稳定，获得条带的多态性较高，且操作简单，因此常被用以鉴定不同细菌，反映群落结构间的变化。

2.3 依赖测序的分子生态学研究方法

随着测序技术的快速发展，微生物结构和功能的研究进入到一个革命性的时代。DNA测序技术可以直接获取样品中核酸物质的序列信息，然后通过系统发育地位分析来判断微生物群落组成的丰富度和多样性，进而对各个物种的生物功能进行预测。微生物群落结构多样性研究中比较常见的手段是16S rRNA基因克隆文库，该技术利用克隆文库获得群落中每一条基因的系统发育地位，进而获取微生物群落组成及多样性的信息。Eckburg等人利用16S rRNA基因克隆文库方法系统分析了肠道内粘膜以及粪便中的微生物菌群组成，全面深入地阐明了肠道菌群结构[9]。此外，某些专门针对肠道微生物特殊功能类群特异性克隆文库的方法也随之发展起来，如利用Clostridium leptum类群和Clostridium coccoides类群特异性的引物来构建类群特异性的克隆文库，分析肠道内C.leptum类群和C.coccoides类群的多样性[10，11]。

3 高通量测序在鱼类肠道菌群研究中的应用

当前，随着国内外高通量测序技术在人类及畜禽动物肠道微生物研究中的广泛应用，使用该技术研究鱼类肠道微生物菌群组成也成为热点。通过对高通量技术的使用，全方位认识对鱼类体内肠道微生物菌群组成比例的影响因素，对改善调节其消化道菌群组成、提高鱼类的生产能力和饲料利用率、降低有害菌群对鱼类的侵害起到十分重要的作用。李彤华等人采用454高通量测序技术对养殖于同一池塘的鲫鱼（Carassiuscuvieri）、草鱼（Ctenopharynodonidellus）和鳙（Hypophthalmichthysnobilis）的肠道内容物、肠上皮粘膜和相关环境样品进行研究，分析样品中微生物菌群结构组成及多样性。随后通过Weighted-UniFra距离进行热图分析（Heatmap analysis）和主成分分析（Principal coordinate analysis），发现不同鱼类的肠道微生物菌群结构组成并非是对其生存环境中的微生物的简单反映，而是来自肠道内部微生物菌群特异性选择压力（尤其取决于种特异性的免疫和代谢）[12]。张皓等人利用高通量测序技术研究了鲤科鱼（鲢、鳙、鲫、鲤、草鱼、青鱼）、南美白对虾养殖池塘中水体、底泥及水产动物肠道微生物群落结构的组成和多样性，探究水体、底泥中的微生物群落与环境因子的互作关系。研究结果不仅加深了人们对养殖水体、底泥和水产动物肠道内微生物群落间相互影响的理解，也为进一步从调控环境因子着手来改善养殖环境中微生物的群落结构、抑制病原微生物、减少南美白对虾和常规养殖鱼类的传染病发生提供理论依据。职通瑞利用16S rRNA测序技术，通过研究和分析凡纳滨对虾肠道内的微生物群落，向人们揭示健康凡纳滨对虾肠道内的微生物组成，阐明了美人鱼发光杆菌（Litopenaeusvannamei）和对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV）对肠道内微生物组成的影响，为人们更好地认识和使用微生态制剂提供理论依据。