酵母富硒培养条件研究进展

周洋枝，苏蒙蒙，路 栋，时 杰，高玉荣

（巢湖学院化学与材料工程学院，安徽合肥 238000）

硒作为一种抗氧化剂，参与阻断体内自由基反应，避免胰岛β 细胞被氧化破坏，维持其正常功能运行，可降低尿糖和血糖，促进人体内糖分代谢[1]。研究发现，癌症发生与血硒水平的高低有着密不可分的关系，硒可调节人体对维生素吸收和相关酶的合成，可抑制致癌物。现如今研究主要集中在通过生物体内转化有机硒，用于开发功能性富硒食品和临床预防及治疗相关疾病，而酵母是有机硒富集最佳载体，富硒酵母可食用安全性和生理活性高，且生产周期相对较短，对人体或动物体内的血硒水平有改善作用，若能实现产业化，可以改善我国食品缺硒现状，带来巨大经济效益和社会效益。

1 用于富硒的微生物类型

可用于富硒的微生物研究较多的主要是酵母和食用菌。用于富硒的酵母主要有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、鲁氏酵母（Saccharomycesrouxii）、葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）、红发夫酵母（Phaffiarhodozyma）、汉逊酵母（Hansenula） 属、球拟酵母（Troulopsis） 属和假丝酵母（Candida） 属等的酵母。用于富硒的食用菌主要包括金针菇、香菇、平菇、灵芝等。

酵母在无机硒转化有机硒方面有很大的优势，为了达到更好的富硒效果，一般要进行菌种诱变改良，获得高产菌株。邹艳等人[2]先对产朊假丝酵母Ⅰ、产朊假丝酵母Ⅱ、热带假丝酵母、鲁氏酵母、球拟酵母5 种菌种进行富硒能力比较，经耐硒驯化筛选出产朊假丝酵母Ⅰ，再进行化学-紫外复合诱变试验，得到U-16 菌株，最终有机硒含量高达95.26%，筛选出性能稳定的菌种可用于富硒产品研制，进而实现大规模产业化，但是筛选过程较繁琐。酵母菌中的红发夫酵母营养成分丰富，含有抗氧化性的虾青素[3]、维生素和蛋白质等物质，因此对红发夫酵母进行富硒培养将成为研究热点。徐洲等人[4]通过对红发夫酵母的硒添加量、培养时间、装液量的研究，确定了培养的最适条件，此时有机硒的转化率可达63.2%。

多形汉逊酵母具有高效、低成本的优点，对今后有机硒制备和还原型谷胱甘肽制备具有重要应用意义。钱卫东等人[5]就富硒- GSH 多形汉逊酵母的发酵参数进行了系统的试验分析，在最适发酵条件下，多形汉逊酵母的无机硒转化率为90%以上。

现在普遍研究的是酿酒酵母富硒，刘杰等人[6]在不同糖度麦芽汁培养基上培养啤酒酵母，经过对比各自菌种生长情况，确定2 °Bx 的麦汁培养基，但研究结果指出酵母得率与报道数据有较大差距，故在原有培养基基础上进行改良，发现适量加入酵母提取物、葡萄糖、硫酸铵和磷酸二氢钾，分别不同程度地提高了酵母的生物量，但葡萄糖、硫酸铵同时过量加入对酵母生物量的提高有抑制作用。机制目前尚未定论，可能与酵母胞内酶和蛋白质运转有关。

2 酵母富硒的培养基

从酵母细胞的组成成分来看，酵母生长对于碳、氮、磷元素的需求很高，一般认为麦芽汁培养基和YPD 培养基是较理想的富硒酵母培养基。在培养基的选择上，大多数使用合成培养基，主要为了满足酵母对微量元素的需求。朱威等人[7]在对啤酒酵母富硒培养时采用培养基配方为蛋白胨1.5%，葡萄糖4.0%，牛肉膏2.0%，磷酸氢二钾1.0%，硫酸铵0.5%，pH 值6.0。

曾东等人[8]分别采用YEPD 液体培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖） 和PDA 培养基（蔗糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，硫酸镁0.05%，琼脂2%，生长因子0.5%，pH 值5.0） 培养富硒酵母，结果表明相同条件下YEPD 培养基培养后菌体的有机硒转化程度远低于PDA 培养基，而YEPD 培养基在菌种生物量的积累上有优势，说明PDA 培养基更有利于硒的富集，而在YEPD 培养基啤酒酵母生长代谢旺盛。这种合成培养基虽然能满足酵母的生长，但是原料成分较复杂、来源有限、成本相对较高，不适合投入大量生产。

范秀英等人[9]采用蔗糖糖蜜为主要培养基，再加入（NH4）2SO40.5%, H3PO40.1%，蔗糖糖蜜天然原料的使用在一定程度上降低了成本，而且指出利用原生质体融合技术构建成的菌株ZFF-28 在60 μg/mL硒质量浓度培养基中，生物量和硒含量均达到较高水平。

印宏绯等人[10]采用多种农副产品原料通过合适配比制成天然培养基（12 Brix 糙米汁∶12 Brix 麦芽汁∶12 Brix 豆芽汁= 4∶4∶2），考查酿酒酵母培养条件，使得有机硒比率达90%以上，同时大大节约了培养基成本。

目前，一些价格低廉、获取途径广泛的农副产品被大量废弃，如糖蜜、麸皮。糖蜜富含有糖类、核酸、菌体蛋白及促生长因子等成分，而麸皮也不乏脂肪、糖类、纤维素和矿物质。因此，以糖蜜作为富硒酵母培养基的基本成分，以麸皮作为辅助原料对啤酒酵母进行富硒培养，将为富硒酵母的开发提供一定的参考依据。

3 酵母富硒的培养条件

在富硒酵母的培养过程中，硒源的添加量、添加方式和培养条件成为酵母富硒培养过程中的主要影响因素。

3.1 硒添加量

考虑到培养基的硒浓度会影响酵母对硒的转化吸收和酵母生物量的积累，低浓度的硒对酵母的生长影响不显著，随着浓度的增加，酵母中的富硒量也随之增加；当培养基中硒的浓度过高时，会抑制酵母的生物量和有机硒转化率的提高。

从有机硒的富集效果方面考虑，王凤琴[11]在麦芽汁培养基中对硒的添加浓度进行单因素分析，综合富硒效果和酵母生长状况，确定150 mg/kg 为最佳硒含量。王岁楼等人[12]对硒源进行筛选后，从经济和技术考虑选定亚硒酸钠，采用15 mg/L 硒质量浓度对郁金香牌高活性酒精干酵母进行富硒培养，硒转化率达83.2%。

为了获得较高的有机硒转化量，研究更偏向于对酵母进行育种筛选后进行富硒。刘培丽等人[13]对啤酒酵母采用化学诱变后，经亚硒酸钠抗性平板筛选出无机硒转化能力强菌株，经过比较生物量，发现N-5-1 菌株具有较强富集硒能力和生长活力。研究表明，当酵母培养液中加入25 mg/L 硒（Se4+） 时，在发酵物中硒含量高达2 454 μg/g。

吴宝强等人[14]研究发现随着酵母菌株不同，对亚硒酸钠的耐受程度差异也较大，在平衡富硒量及酵母生物量二者后，确定硒酵母培养基的最佳初始硒质量浓度为25 μg/mL。

在实际生产过程中，应该根据菌种类型、是否进行耐硒训练和诱变处理等情况来确定最佳加硒质量浓度，以获得具有高富硒量和高生物量的酵母菌种来优化酵母富硒生产参数。

3.2 加硒方式

在酵母菌的培养过程中，其繁殖过程一般会经历4 个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。因为对数期的酵母菌繁殖速率最快，所以在这个时期的前期加入硒源有利于硒的富集；考虑到硒源被酵母菌吸收后会转化到次级代谢产物中，在稳定期的前期硒源应该加到培养基中；在富硒培养的初期，应少量添加硒源，这样避免了高浓度的硒对酵母生长的抑制作用；在发酵中后期，应逐步增加硒的添加量，这样有利于硒的转化。因此，应该采取分批次添加硒源。

在分批次添加硒源时，刘杰等人[6]考虑到大于30 mg/L 初始的Na2SeO3·H2O 对酵母细胞的得率有影响，所以在进行酵母富硒培养时，提前添加一定质量浓度（5～30 mg/L） 的Na2SeO3·H2O，且分别培养到12，16，19，22 h 后补加10 mg/L Na2SeO3·H2O，使硒源总添加量在45～70 mg/L。研究发现10 mg/L Na2SeO3·H2O 初始添加量有利于硒的富集和酵母的生长，而超过10 mg/L 则使酵母生长受到抑制。

娄兴丹等人[15]在富硒土壤中筛选出黏红酵母RhodotorulaglutinisX-20，分5 次添加质量浓度为50 μg/mL 的Na2SeO3，分别在培养的6，9，12，16，24 h，黏红酵母富硒情况表明，在12 h 时添加硒盐效果最佳，酵母富硒量为2 520.65 μg/g，菌种生物量为4.21 g/L。

史泽旭等人[16]为促进菌种生长和有机硒的富集转化，改变了传统碳源和Na2SeO3的添加方式，采用碳源指数流加法和亚硒酸钠流加法，使有机硒转化率较恒速流加提升了8.1%，酵母干质量可达1.5 g/L，该流加硒源方式将为富硒酵母工业化生产提供新思路。

3.3 培养条件

不同的培养条件会影响酵母的富硒能力和酵母干重的积累，蔡飞等人[17]研究库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii） Z5 发酵条件，在优化接种量时，分别对4%，6%，8%，10%，12%接种量进行试验，终确定10%接种量效果最好，在最佳培养条件下，总硒含量可达到862 μg/g，生物量为9.63 g/L。

除了酵母接种量、碳源及加硒方式会对生物量和富硒含量有影响外，温度、pH 值、接种量、装液量也会对此产生影响。何彩梅等人[18]从自然柑橘果酒筛选分离出假丝酵母，确定其对75 μg/mL 亚硒酸钠有最佳转化效果后，在温度为32 ℃，初始pH 值为4.4，接种量为5%，装液量为200 mL/250 mL 的摇瓶条件进行培养，优化后菌株生物量高达2.57 g/L，总硒含量测得可达4 756.76 μg/L。

孙平平等人[19]通过单因素试验分析和正交试验设计研究了安琪活性干酵母培养温度、初始pH 值和转速等发酵条件对酵母生物量及富硒量的影响，并确定了最优方案为培养温度30 ℃，初始pH 值5.0，转速160 r/min，培养时间40 h，最终生物量达到9.89 g/L，同时取得较好的富硒效果。

4 结语

富硒酵母是在酵母培养中加入亚硒酸钠，通过酵母的生长及代谢过程转化为有机硒。用富硒酵母作为原料，可进一步加工成富硒酵母抽提物，作为营养添加剂和保健产品及药物原料。现阶段，国内已有以富硒酵母为主要成分的北大富硒康口服液，食品级的富硒酵母等商品在售。目前，大多数富硒酵母培养基使用的是麦芽汁培养基或者合成培养基，今后有待于以糖蜜、麸皮为原料来制作富硒酵母的培养基，进一步优化富硒培养条件，降低生产成本，提高产品有机硒含量，为降低富硒产品价格提供有效的解决途径。