蜂产品指纹图谱的研究进展

张敏倩，刘功良，赵晓娟，赵文红，白卫东，蔡金鑫，何家全

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225；2.安徽盼盼食品有限公司，安徽滁州 239001；3.广州市宝生园股份有限公司，广东广州 510100）

作为纯天然的营养保健品，蜂产品具有预防和治疗多种疾病的功效。与其他国家相比，我国在养蜂方面属于世界第一大国，多种蜂产品产量位居世界之首。目前，不规范的环节在蜂产品（如蜂蜜、蜂胶）的生产和流通中仍广泛存在，其中，人为掺假最为普遍。然而，如今的国家标准复杂繁琐，以致于难以满足快速准确的检测需求。除此之外，蜂产品的质量在现行的制度体系下难以保障。因此，利用指纹图谱等当代分析方法对提高蜂产品品质具有重要意义。

如今，食品行业尤其是药物化学中的中药行业，指纹图谱技术已经得到了广泛的应用。而在蜂产品行业中，如不同品种的蜂蜜中会存在微量的生物活性物质和非活性物质，通过指纹图谱技术检测这些特征物质能够有效区分蜂蜜的植物源并用于蜂蜜的品质控制，尤其在蜂蜜的成分分析和真伪鉴别中；除此之外，对于蜂胶的植物源、成分和真伪的鉴别也极具实际应用意义。

1 指纹图谱的简介及种类

指纹图谱技术建立于现代仪器分析、数学统计手段和计算机模拟方法的基础之上[1]，是一门可通过特定的信息化处理后能对产品进行分析识别的技术，可将蜂产品中特有的品质，如香气、滋味、元素组成、形状、色泽等进行品质优劣判别和真伪识别[2]；对于品种鉴定工作，具有快速、方便、准确、不易受环境影响等特点。

指纹图谱技术根据测定方法的差别可分为色谱指纹图谱与光谱指纹图谱两大类，其中，气相色谱指纹图谱和液相色谱指纹图谱属于色谱指纹图谱；红外（IR）指纹图谱、紫外（UV）指纹图谱、核磁共振谱（NMR）指纹图谱、质谱（MS）指纹图谱等属于光谱指纹图谱。IR主要用于纯物质组分鉴定，UV则能够在一定程度上反映样品中各化学成分的差异。

2 蜂产品在色谱指纹图谱中的应用

2.1 气相色谱指纹图谱

气相色谱法（GC）是一种分析速度快、灵敏度高、运用规模大、可分析和分离繁杂混合物的手段。此外，其他近代分析仪器与气相色谱法的联用技术也因易操作、高灵敏等特点被广泛用于蜂产品成分、结构的常规分析，如气相色谱与质谱联用（GC-MS）。

夏立娅等人[3]研究枣花蜂蜜中挥发性成分的指纹图谱，利用固相微萃取技术与气相色谱法联用（SPME-HPLC）先分离检测枣花蜂蜜中的挥发性成分，并根据检测结果建立指纹图谱，为科学评价及有效控制枣花蜂蜜质量提供依据。涂世等人[4]通过超声波辅助萃取法提取49种油菜单花蜜的挥发性物质，并利用气相-氢火焰化离子检测（GC-FID）和GC-MS技术分析，随后进行聚类分析和相似度分析，从而建立油菜单花蜜挥发性成分的指纹图谱。结果表明，试验所用的油菜蜜分为5类。未经加工的原料油菜蜜和市售油菜蜜中的挥发性成分差异显著。苯甲酸-4-羟基-3,5-二甲氧-酰肼可作为油菜蜜植物源标记物。姚伟宣等人[5]建立了Fe3O4/AMWNTs磁性分散固相萃取-气相色谱测定6种菊酯类农药残留的分析方法，该方法可用于2种市售蜂蜜中菊酯类农药的残留分析，回收率高于78.4%。该方法能有效检测蜂蜜中痕量菊酯农药的残留量，具有易操作、高灵敏度的优点。王蓓等人[6]采取SPME-HPLC分析了蜂胶超临界CO2萃取物中不同香气的挥发性成分，确立了国产蜂胶超临界CO2萃取物GC-MS指纹图谱，该图谱由8个共有峰及其相关信息构成。对GC-MS分析数据进行聚类分析并结合我国地理区划特征。结果显示，黑龙江、河北、云南、海南、山东、河南、湖北、湖南和四川的蜂胶超临界CO2萃取物特征成分组成相近。肖利龙等人[7]建立了QuEChERS-气相色谱法对蜂花粉中9种有机氯类和6种拟除虫菊酯类农药残留进行定性定量的分析。结果表明，该法能有效分离9种有机氯和6种拟除虫菊酯农药，峰形良好，具有简单、快速、高效的优点。

2.2 液相色谱指纹图谱

高效液相色谱（HPLC）在色谱指纹图谱中应用最为广泛[8]，不仅可应用大部分的有机物，还具有检测速度快、检测效率和灵敏度高等特点。近年来，作为一种准确快速、易于自动化的检测方法，HPLC在食品分析中的应用中得以快速发展。当前，HPLC广泛应用于蜂产品成分的定量与定性的常规分析，对于蜂产品的品质控制和真伪判别具有极高的应用前景；反相液相色谱在类黄酮成分分析方面均有报道；高效液相色谱-质谱（HPLC-MS） 联用，可以将色谱图中未知成分的各峰进行归类。

在仅采用HPLC方面，王文静[9]对洋槐蜂蜜黄酮类化合物指纹图谱进行了研究，由25种供试样品色谱图得出，我国的洋槐蜂蜜黄酮类化合物在品种和含量上存在差异；供试样品中含有芦丁、棚皮素和山奈酚。陈磊等人[10]采用HPLC检测新西兰Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛。结果表明，该方法不仅可用于新西兰Manuka蜂蜜的品质控制，也适用于中国蜂蜜中甲基乙二醛的检测，具有前处理过程简单、良好的灵敏度、回收率和重复性的特点。李樱红等人[11]采用HPLC，通过《中药指纹图谱相似度计算软件》计算，对蜂胶、杨树胶、蜂胶中掺杨树胶或外源性黄酮类化合物等样品的相似度范围进行了限定，从而建立区分蜂胶与杨树胶的指纹图谱，为蜂胶真伪鉴别和品质控制提供依据。该方法重复性好、准确度高。宁生荣等人[12]建立油菜蜂花粉的HPLC指纹图谱，为其品质评价提供参考。对油菜蜂花粉样品进行色谱分析后，建立其指纹图谱。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度评价，并运用聚类分析（HCA） 对指纹图谱进行模式识别。通过一系列结论表明，建立的指纹图谱可对其品质评价及控制提供依据。

在采用HPLC与其他技术联用方面，王韦岗[13]确立了固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）测定蜂蜜中克伦特罗残留量的方法，并对样品前处理方法和色谱条件进行了优化。当流动相为甲醇－磷酸盐为时，采用MCX和HLB固相萃取柱，具有高灵敏度、高回收率、少杂质组分干扰等优点。涂剑秋[14]建立了可靠、灵敏的反相高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）方法，可测定蜂蜜中3种有机酸类电化学活性化合物（没食子酸、绿原酸、咖啡酸）。韩红祥等人[15]建立不同基源蜂胶的指纹图谱，为蜂胶药材的品质控制提供依据。结果表明，建立的HPLC-MS指纹图谱具有较好的精密度、重现性和稳定性，可作为蜂胶品质评价主要依据之一。

3 蜂产品在光谱指纹图谱的应用

3.1 近红外光谱

近红外光谱源于化合物中含氢基团C-H，O-H，N-H，S-H，P-H等振动光谱的倍频以及合频吸收。而不同基团在近红外光谱的波长范围（780～2 500 nm）内对应的峰位、峰强和峰形不同，根据这些差异可进行定性和定量分析，从而快速获得分析数据[16-17]。近红外光谱技术具有易操作、低检测成本、高分辨率、高稳定性等优点，也因其分析速度快、数据采集时间短、仪器的环境适应性强而被广泛地应用于食品、农产品等领域[18-19]。

不同种类或品质的蜂蜜，其对应的光谱特征不尽相同。因此，蜂蜜光谱特征可作为区分纯蜂蜜与掺假蜂蜜的指标，也可用于判断蜂产品品质的优劣。目前，近红外光谱技术在蜂产品品质评定与真伪鉴别方面已普遍运用。

近红外光谱技术应用于蜂蜜内部品质检测研究方面，邱琳等人[20]利用近红外光谱仪（NIRS） 和近红外定量分析技术快速测定蜂蜜中主要成分（水分、果糖、葡萄糖和还原糖）含量，建立蜂蜜主要成分的近红外定量分析模型。该方法方便、快速、准确地测定蜂蜜的主要成分。侯瑞丽等人[21]利用NIRS检测蜂蜜中的水分含量、蔗糖含量、还原糖含量和淀粉酶值，红外分析结果与常规化学测定结果关系相关，标准误差较低。这说明近红外光谱可应用于蜂蜜中蔗糖分析以及测定蜂蜜品质参数。陈兰珍等人[22]选取68个蜂蜜样品，利用傅里叶变换近红外光谱（FTIR） 结合偏最小二乘法（PLSR），建立了蜂蜜中果糖含量的近红外光谱模型。李水芳等人[23]创立了一种利用NIRS研究蜂蜜中可溶性固形物含量（SSC）的技术，并分析了蜂蜜中的水分。用PLSR分别建立了SSC和水分的近红外透反射光谱校正模型。研究表明，近红外光谱能够准确测定蜂蜜中SSC和水分。上述研究证明近红外光谱技术可用于蜂蜜内部品质的检测。

在蜂产品的产地和植物源判别研究方面，董蕊[24]采用FTIR建立了苔子蜜、椴树蜜和刺槐蜜的指纹图谱。利用该技术可有效区分苔子蜜、椴树蜜和刺槐蜜的品种、产地和品质，可作为市场上评估蜂蜜品质的参考方法之一。李水芳[25]同时应用NIRS联用化学计量学方法，建立了苹果蜜产地和油菜蜜产地的判别模型。研究表明，用小波变换（WT） 结合线性偏最小二乘-线性判别分析（PLS-LDA） 建模更适于蜂蜜产地判别，具有快速判别蜂蜜产地的优势。杨娟[26]采用NIRS并结合化学计量学方法，构建了鉴别3个蜂胶品种的识别模型。马氏距离判别、典型判别、分析中建模集与检验集的总体判别的结果均良好。因此，近红外光谱技术能够对杨树型蜂胶、桦树型蜂胶和橡树型蜂胶进行较好分类。上述研究证明近红外光谱技术可用于蜂产品产地和植物源判别的检测。

在蜂蜜真假鉴别中的研究方面，李水芳等人[27]同时为进一步检验近红外光谱技术判别蜂蜜掺假的能力，利用近红外光谱联用化学计量学方法对掺入不同浓度甜菜糖浆的蜂蜜进行了定性、定量检测。研究表明，蜂蜜中掺入甜菜糖浆后，NIRS可以快速鉴别蜂蜜的真假性，但对于蜂蜜中掺假量的定量分析无法实现。陈桂云等人[28]采用近红外光谱研究了掺入不同浓度高果糖浆的9种原蜜，结果验证了短波近红外光谱技术可用于蜂蜜掺假鉴别。上述研究证明近红外光谱技术可用于蜂蜜真假鉴别的检测。

3.2 中红外光谱

中红外光谱具有与近红外光谱一样的检测快、灵敏度高的优点，且均提供了有机分子的振动信息。不同在于其波数范围为4 000～400 cm-1，所检测到的是分子振动的基频吸收，优于近红外的检测限，所表达的样品信息量更加丰富，更能体现出样本的信息[29]。目前，中红外光谱分析技术大多用于蜂蜜真伪判别上。同时，在对植物源的判别的研究中、对不同植物源蜂蜜进行鉴定和分类中，中红外漫反射光谱联用多变量分析技术具有应用意义。

杨娟[26]同时采用中红外光谱技术联用化学计量学方法，创建了鉴别5个蜂蜜品种的识别模型和蜂胶品种真实性的识别模型。典型判别分析法显示，样品在建模集和检验集的总体判别准确率相对较高，因此，中红外光谱技术结合典型判别分析不仅可以较好地对荔枝蜜、荆条蜜和油菜蜜进行品种鉴别，对于蜂胶真伪鉴别也具有一定的可行性。

梁奇峰[30]运用中红外光谱对纯蜂蜜和掺假蜂蜜进行鉴别，结果表明，不同品种的纯蜂蜜红外光谱大致一样，但掺有葡萄糖、蔗糖、黄糖等物质的掺假蜂蜜，其红外光谱与纯蜂蜜在2个波段范围中有明显的区别。因此，利用中红外漫反射光谱联用多变量分析技术对不同植物源蜂蜜进行鉴定和分类，进行中红外漫反光谱和一阶、二阶导数变换后，再分别利用PCA，LDA和聚类分析方法对不同植物源蜂蜜进行分析。结果表明，采用LDA和聚类分析方法可以获得将近100%判别正确率。吴杰等人采用FTIR联用二阶导数谱和热扰动下的二维相关红外光谱技术的三级红外宏观指纹图谱法，对6种不同花粉（杏花花粉、油菜花粉、茶花花粉、西瓜花粉、荷花花粉和虞美人花粉）进行了快速无损的鉴别。结果表明，6种花粉不仅在一维和二阶导数谱图可看出明显差异，通过二维谱图还可以准确鉴别不同花粉品种。因此，三级红外宏观指纹图谱法是鉴别不同蜂花粉种类的一种有效和快速检测方法。

3.3 紫外光谱

紫外-可见吸收光谱是由分子中价电子能级跃迁产生的，利用物质的紫外-可见吸收光谱的形状、吸收峰的数目及最大吸收波长的位置可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定、推断。因此，利用紫外光谱可有效地进行蜂产品的品质区分和真伪鉴别。

张婷婷对37个中国蜂胶的醇提物（EEP） 进行紫外光谱（UV）扫描，并对UV扫描数据进行主成分分析（PCA） 和线性判别分析（LDA） 分析。PCA和LDA的结果均表明，该模型可对不同颜色蜂胶进行有效区分。故UV结合多变量分析可将不同品质的蜂胶进行区分。丁青芝等人采用紫外光谱对东北黑蜂蜂胶乙醇提取物（EENBP） 的进行了分析。结果表明，东北黑蜂蜂胶的醇提物与其他地区的蜂胶存在共性，基于获得的提取物在波长292 nm处有最强吸收，表明东北黑蜂蜂胶有可能具有较强的抗氧化性；蜂胶提取物的紫外光谱特征明显，有望用于蜂胶真伪鉴别和产地鉴别。

3.4 核磁共振

在化学、生物、医学等领域中，氢核磁共振（NMR）是一种能够解析有机小分子和生物大分子结构的研究和分析测试工具。NMR技术因具有样品预处理简单、无损伤性，可进行实时和动态的检测、试验方法灵活等优点得到广泛应用。

杨娟[26]同时构建基于核磁共振光谱技术结合化学计量学方法鉴别5个蜂蜜品种的识别模型。通过典型判别分析和组质心区分可知，核磁共振光谱技术可以椴树蜜、洋槐蜜和油菜蜜进行较好的品种判别。陈雷等人利用氢核磁共振谱图结合正交偏最小二乘（OPLS）法对油菜蜂蜜和果葡糖浆掺假蜂蜜进行判别分析。结果表明，在OPLS得分图中能明显区分油菜蜜和果葡糖浆掺假蜂蜜样品，可实现油菜蜜中果葡糖浆掺假的快速鉴别。该方法是基于对蜂蜜成分的整体分析，为蜂蜜品质监控提供了一种新思路。Ribeiro等人利用低频的氢核磁共振（LF-1H-NMR） 检测掺有不同浓度高果玉米糖浆蜂蜜的纵向弛豫时间T1和横向弛豫时间T2。结果表明，不同掺假比例的蜂蜜的pH值、颜色、水分含量、水分活度和灰分在T2上均具有差异性，说明LF-1H-NMR可以用于区分纯蜂蜜和掺杂有高果糖玉米糖浆的蜂蜜。郑馨通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA），以TSP作为内标，采用氢核磁共振检测对不同花源、产地和生产日期的蜂蜜样本进行分析。结果表明，氢核磁共振检测与多变量统计方法相结合能有效分辨不同蜂蜜间的差异，鉴别蜂蜜的真伪。

4 结语

具有保健功能的蜂产品因其天然、健康、养身等功效广受群众的欢迎。然而，正因为消费需求大，商家为了提升竞争力，出售低价格的掺假蜂蜜或蜂胶；除此之外，在蜂产品的生产与原料环节也频发问题，从而导致目前市场上蜂产品的食品检测合格率低。为了提高蜂产品品质，保证蜂产品市场的安全与秩序，可利用指纹图谱的多样性鉴别蜂产品的真伪和质量的优劣，从而为生产商的安全生产、各级检验部门的质量抽查，为消费者安全、放心的食用蜂蜜提供更有效的保护技术。此外，在蜂产品的研究开发中，利用指纹图谱可以有效地反映蜂产品中的各种化学成分及其工艺贮存过程中的变化，从而有效地跟踪蜂产品研究进展，使研制的蜂产品品质更可靠、稳定。

因此，指纹色谱技术不仅可作为蜂产品检测的主要凭证，还能为蜂产品研发等问题提供技术保证，从而优化蜂产品市场，使其走向规范化、品质化和国际化。为了实现这个目标，可通过完成基础工作，如确定有效成分以及收集产地、采收期及酿造加工方法等资料，从而建立全面的蜂产品指纹图谱库，更好地为人类的健康服务。