影响产油酵母菌合成油脂的因素研究现状

陈 韵，钟先锋，陆丽珠，张 瑾，梁舒妍，江志彬，王漫君

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山 528225）

微生物油脂也称单细胞油脂，可由多种产油微生物产生，包括丝状真菌、微藻、细菌、酵母菌等[1]。根据油脂的脂肪酸组成不同，微生物油脂可用于多种用途。富含饱和及低度不饱和的长链脂肪酸，且脂肪酸组成与动植物油相似的微生物油脂，可用于生产生物柴油或可可脂替代品[2]。另一方面，微生物油具有丰富的多不饱和脂肪酸（PUFAs），可以应用于保健品和必需脂肪酸的生产[3]。

产油微生物种类繁多，就单细胞油脂的生产而言，酵母菌与其他微生物相比具有许多优点。首先，与微藻相比，酵母菌的发酵受气候的影响较小，另一方面，酵母菌还可以利用多种多样的糖类和其他简单化合物作为碳源。再者，与真菌相比，酵母菌对氧气的需求量更低，对金属离子也具有更高的耐受性。此外，由于细胞体积较大，酵母菌细胞比细菌更容易收获。根据相关报道，与其他微生物相比，酵母菌较容易进行基因工程改造。因其优点突出，含油酵母的脂质生产在近几年来一直是各国的研究热点之一[4]。但含油酵母菌产油发酵受多种因素影响，主要有pH 值、温度、发酵时间、接种量、溶氧量等的培养环境条件和碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体物质等培养基成分[5]。在利用酵母菌发酵产油脂的过程中，通过控制培养环境条件和添加不同的营养成分，可得到不同脂肪酸组成的微生物油脂，实现微生物油脂在不同行业中的应用[6]。主要针对影响产油酵母菌发酵产油脂的培养环境条件和培养基成分等因素进行了综述，以期为产油酵母菌生产微生物油脂的工业化发展提供参考。

1 产油酵母

在已知的约600 种酵母中，只有不到30 种是产油酵母，其中有代表性的有耶氏酵母属、隐球酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、根霉菌属、毛孢子菌属和油脂酵母属[7]。大多数油脂酵母体内油脂含量达40%，一些产油酵母菌株甚至可以积累高达70%的中性脂质。

常见的油脂酵母主要有解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）、弯曲隐球酵母（Cryptococcus curvata）、白色隐球酵母（Cryptococcus albidus），其中解脂耶氏酵母被证明可以将农用工业残留物、工业甘油和废弃脂肪转化为甘油三酯[8]；圆红冬孢酵母油脂含量最高，但利用废液的能力较差[9]。

2 影响产油酵母生产油脂的环境条件

2.1 接种量

接种量能够影响酵母菌的生长和油脂产量[10]。接种量较小时，发酵液中的生物量较少，油脂产量会相对较少；接种量越大，一般越有利于细胞生长，但脂质积累有最佳的接种浓度。有研究发现，随着接种量增加，油脂产量不断增加并达到较大产量，继续增加接种量，油脂产量反而会下降[11]。据Liu L P 等人[12]推测，较高的接种量有利于细胞内多糖的合成，因此接种量越高菌体生长越旺盛，但较高的接种量可能会增加氮浓度，从而诱导降低发酵培养基中C/N 比，而这是不利于脂质积累的。Chen X F 等人[13]也发现在木质纤维素水解产物上进行产脂发酵时，过高的接种量不利于微生物油脂的积累。

2.2 pH 值

pH 值是影响微生物正常生命活动的重要因素。培养基pH 值会影响到合成油脂过程中关键酶的活性和微生物细胞膜的结构。当pH 值发生变化时，发酵液中离子的浓度也会发生改变，过高或过低的离子浓度都会影响细胞对培养基中离子的吸收和利用，最终影响菌体的生产繁殖和油脂积累[14]。胡洋[15]考查了pH 值4.0～8.0 对T. fermentans，T. cutaneum 和L. starkeyi 产油脂的影响，随着pH 值增大时，3 种酵母菌的生物量、油脂含量和油脂产率都在不断增大；当培养基的初始pH 值超过6.0 时，以上指标均开始减小。周晶[16]也发现，当发酵液的pH 值过高或过低时，菌体生长繁殖都会受到抑制。

2.3 温度

温度是酵母菌培养最重要的环境因素之一，通常在最终发酵油脂产量中起关键作用。大多数酵母菌的最佳发酵温度为28～32 ℃。例如，酵母菌倾向于在低于20 ℃的温度下减慢生长，而在高于35 ℃的温度下其生命活动基本上被抑制。因此，控制培养温度能够获得较高产量的微生物油脂。李楠[17]考查了温度对微生物的生长和积累油脂的影响。结果表明，培养温度较低时，微生物生长缓慢，生长迟缓期长；随着环境温度的提高，微生物生长速度加快，其生长周期缩短，油脂产量也显著提高。但是，在35 ℃时菌种停止生长，说明低温和高温均不利于微生物的生长。因此，脂肪酶的活性具有温度依赖性，酵母菌油脂的产生与培养温度有关，这可能源于在较低或较高温度下参与脂质合成酶的部分失活。

2.4 溶氧量及摇床速度

在摇瓶发酵培养中，发酵液中溶氧量的控制主要是通过控制摇床速度来实现，摇床速度越快，发酵液中的溶氧量就越大，反之则越小。产油酵母在发酵产油脂的过程中需要消耗氧气，在适当的转速下，发酵液中氧气供应充足，有利于微生物油脂的积累，当摇床速度过快，菌体生长速度过快，耗氧代谢旺盛反而不利于油脂的积累。同时，过快的速度容易损伤菌体，甚至导致菌体自溶死亡，最终使菌体油脂含量下降。王莉等人[18]研究了摇床速度对菌体产油脂的影响，在转速190 r/min 时，生物量和油脂产量均达到最大值，当摇床速度过高或过低时，以上指标均会下降。

2.5 培养时间

Ma Y Q 等人[19]发现，培养时间的长短对油脂积累和脂肪酸的组成起着重要的作用。培养时间较短时，菌体主要利用营养物质生长繁殖，此时菌体处于对数期，生长旺盛，但是油脂未完全形成，菌体积累的油脂量较少；培养时间过长，发酵液中的营养物质基本被耗尽，继续培养会导致菌体处于饥饿状态，此时菌体为了维持正常的生命活动会消耗自身产生的油脂来获得能量，菌体处于衰亡期，最终会死亡而自溶，从而导致油脂产量下降。王斐[1]研究了不同培养时间对D5-2 菌株油脂的影响，结果表明，发酵初期菌体的生物量和油脂含量迅速增长，到了8 d 后，随着时间的增加，油脂含量和生物量均呈下降趋势，说明此时菌种处于衰亡期。

3 影响产油酵母生产油脂的培养基成分

3.1 碳源

碳源作为酵母菌生长和产脂质的重要营养成分，在氮源缺乏的情况下，酵母菌利用碳源代谢合成油脂。常见的碳源有糖类（葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉）、二氧化碳、碳酸盐、脂类、有机酸等，考虑到生产成本，目前已经探索了许多不同种类的可再生和廉价碳源用于异养含油微生物的脂质生产，包括木质纤维素、非谷物糖原料、粗甘油、食品废水、工业有机废物、甲壳素、菊芋等[18，20]。不同种类的碳源会影响微生物生长繁殖和油脂合成，不同种类的酵母菌所能利用的碳源也不同。孙登岳[20]添加不同种类碳源到培养基中，发现葡萄糖最适宜ZL2-103 菌株发酵产油脂，相对于葡萄糖来说，木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖及麦芽糖不太适合ZL2-103 发酵生产油脂。

3.2 氮源

氮源是在菌种生长和油脂合成过程中必不可少的营养物质，主要用于构成微生物的蛋白质、细胞质等物质，常见的氮源包括有机氮（蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、尿素等） 和无机氮（NH4Cl，NaNO3，NH4NO3等）[21]。有研究表明，无机氮源比有机氮源更有益于脂质积累，使用的氮源可能通过氮代谢的差异来影响脂质的合成[21]。Poli J S 等人[22]评估了由3 种有机氮源（酵母提取物、胰蛋白胨和尿素） 和2 种无机氮源（[NH4）2SO4和NH4NO3]组成的5 种氮源促进脂质积累的能力，也发现无机氮比有机氮更能诱导脂质的合成。

3.3 C/N 比

C/N 比也是影响脂质生成的重要参数。研究表明，当发酵液中碳源供应充足、氮源不足，或者人为进行氮源剥夺的情况下，能够促进微生物脂质的积累[23]。一般情况下，高的C/N 有利于脂质的积累并促进菌体的生长，但较高的C/N 会导致菌体生物量下降。Lui L P 等人[12]研究了C/N 比范围在40～140 对L. starkeyi 菌体生长和脂质积累的影响，试验通过改变氮源浓度实现不同的C/N 比，发现随着C/N 比从40 增加到60，生物量从16.8 g/L 提高到18.3 g/L，但随着C/N 比进一步增加，生物量逐渐降低，菌体的油脂含量会不断增加。研究认为，L. starkeyi 的生物量下降可能是由于氮源浓度的降低[12]。这说明氮源供应充足时，有利于细胞的生长繁殖，氮源缺乏和碳源充足的情况下，碳源会进一步代谢成为油脂并存储在菌体中。

3.4 无机盐

除了有限的氮源外，添加无机盐对不同的含油微生物的生长和脂质积累有显著的效果，无机盐包括金属离子，以及S，P，Mg 等微量元素，研究发现金属离子能够参与细胞膜的构成，还会影响脂肪酶的活性，进而影响油脂的积累。向培养基中添加适量无机盐能够调节发酵体系的pH 值大小和渗透压，有利于体系中油脂的积累和稳定。Chen X F 等人[13]通过添加不同种类的无机盐到玉米芯酸水解产物中，结果发现添加适量无机盐能够显著刺激菌株T. cutaneum CH002 的生长和油脂的合成。

3.5 前体物质

前体物质是指微生物油脂在合成过程中所产生的中间物质（如辅酶A、甘油、柠檬酸、苹果酸等），在微生物油脂合成过程中添加这类物质，能够刺激体系中油脂的合成，从而提高油脂的含量[23]。王斐[1]通过响应面优化法研究了辅酶A、甘油、柠檬酸等前体物质对D5-2 菌株产生长及产油脂的影响，结果表明，添加前体物质能够显著提高油脂产量，这些物质按一定的比例混合加入，其效果比加入单一的物质更显著。

3.6 生长因子

生长因子是在酵母菌培养中加入到培养基中的物质，这些物质能够影响体系中脂肪酶活性，如乙酸盐、氨基酸，以及某些维B 类物质，可提高油脂的含量。孙登岳[21]通过添加乙酸盐来实现对脂质代谢调控，李楠[17]通过添加维B1和维B6来提高油脂的不饱和度。

4 结语

目前，微生物油脂正广泛应于生物柴油的生产，作为一种生物可再生原料，可以通过微生物利用各种碳源生产得到，也可以通过各种技术和途径有效培养和收获，通过控制pH 值、温度、溶氧量，或者添加无机盐、前体物质等能够增大油脂产量，还能够进一步增大目标脂肪酸所占比例。然而，开发大规模微生物油脂生产还面临很多的限制和挑战。因此，应该紧急开发和设计一些解决方案用于未来的工业化生产，包括廉价碳源的开发、含油微生物的筛选和改良、高效细胞壁破碎的开发、采油技术与新型微孔催化剂的开发和再生技术等。