企鹅巴氏杆菌分离鉴定及药敏试验

李浩然 刘晓涵 姜承源 褚家宏 王慧*

（临沂大学农林科学学院动物医学系276005）

巴氏杆菌病（Pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida)引起的多种动物和人的重要共患传染病的总称[1]。多杀性巴氏杆菌属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae)的巴氏杆菌属（Pasteurella)，是一种两端钝圆的短杆菌或球杆菌，不形成芽孢，无鞭毛，不运动，兼性厌氧，革兰氏染色为阴性，瑞氏染色镜检菌体可见典型的两级着色，该菌抵抗力一般，阳光直射或高温可将其杀死，一般消毒剂在低浓度下也可将其杀死。

多杀性巴氏杆菌最早由Pasteur发现[2]，在2000年以前，我国关于家禽巴氏杆菌的发病报道较多见[3]，主要集中于家禽，但这之后的相关报道较少，而由企鹅源性的多杀性巴氏杆菌病感染引起的死亡病例更不常见，本试验通过对企鹅多杀性巴氏杆菌的分离，对今后更好研究该病原奠定一定基础，并通过药敏试验对相关疾病的临床诊断和用药治疗提供参考。

1 试验器材与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

2018年4月临沂市某水族馆2只企鹅发病，其中1只死亡。临床主要表现为发病企鹅体温升高达43℃以上，一改往日的活跃现象，精神沉郁，羽毛凌乱，腹泻情况严重，食欲减退或废绝，行走缓慢无力，排灰绿色粪便，粪便中含少量血液。剖检主要病理变化表现为皮下、呼吸道、消化道、腹腔黏膜和脂肪有出血点；心包增厚，内有大量淡黄色积液，心外膜有出血点；肝脏肿大，呈紫红色，表面有灰白色针尖状坏死点；十二指肠黏膜充血、出血，肠内容物中含有血液，黏膜红肿。

1.1.2 培养基及试剂

普通营养琼脂（购自北京陆桥技术有限公司）、THB培养液（购自杭州天和微生物试剂有限公司）、半固体培养基（购自北京陆桥技术有限公司公司）、哥伦比亚培养基（购自杭州天和微生物试剂有限公司）、三糖铁培养基（北京陆桥技术有限责任有限公司生产），巴氏杆菌生化常规微量鉴定管（购自浙江省军区后勤部卫生防疫检疫检验所）、瑞氏染色液、革兰氏染色液等。

1.1.3 药敏试验纸片

新生霉素、庆大霉素、氨苄西林、阿莫西林、青霉素、链霉素、氟苯尼考、环丙沙星、土霉素、呋喃唑酮等药敏试纸片均由本实验室制备。

1.1.4 试验动物

试验用7周龄健康小白鼠25只，购于临沂市卫生学校试验动物养殖中心。

1.2 试验仪器

手术刀；玻片；试管；酒精灯；镊子；接种环；培养皿；1ml注射器；FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司制造2003年12月出厂）；5ml注射器；电热鼓风干燥箱（山东龙口先科仪器公司制造2000年12月出厂）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；420型电热恒温培养箱（山东龙口先科仪器公司制造2000年12月出厂）；烧瓶；游标卡尺；恒温水箱（HS-3001上海康华生化仪器制造厂）；高速台式离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）；超净工作台（SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术公司制造2004年出厂）；SA300PL普通光学显微镜（北京泰克仪器有限公司生产；2001年生产）。

2 试验方法

2.1 病原菌分离鉴定

2.1.1 各种培养基的制备

按规格分别配制普通营养琼脂培养基、血清半固体培养基、THB固体培养基（加入1.5%琼脂粉）、THB液体培养基、哥伦比亚血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁培养基按常规进行配制。营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁培养基121℃灭菌30min，THB培养基与哥伦比亚血琼脂培养基121℃灭菌15min，倒入平板和试管，4℃放置备用。

2.1.2 病料涂片染色

取病死企鹅肝脏、心血、脾脏及纯培养物涂片，干燥，革兰氏染色。将抹片置于空气中自然干燥；火焰固定，将已干燥的抹片菌膜向上，在火焰上缓缓来回通过3次（用手背触及抹片反面，以不烫手为宜）。染色， （1）初染，在固定的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液染色1～2min，水洗。 （2）媒染，再加革兰氏碘溶液于抺片上，助染1～2min，水洗。 （3）脱色，用95%酒精滴于载玻片上脱色约30s。应将玻片不时摇动，至无色素脱下为止，水洗。 （4）复染，用沙黄染液复染1min，水洗。 （5）吸干或自然干燥。镜检观察；瑞氏染色：抹片固定好后，按涂抹点大小，盖上一块略大的清洁滤纸片，在其上轻轻滴加瑞氏染色液，至略浸过滤纸，并看情况补滴，维持不使变干；染色3min后，滴加与染液等量的中性蒸馏水，轻轻晃动玻片，使与染液混匀，经3min，除去滤纸片，直接用水冲洗，吸干或烘干，镜检[4]。

2.1.3 分离培养与观察

在无菌条件下，将肝、脾等病料接种于营养琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基、三糖铁培养基观察其生长情况，37℃培养24h后观察细菌生长情况，并挑取单菌落无菌划线接种于THB固体培养基、哥伦比亚血琼脂培养基，37℃培养24h，另挑取单菌落接种于THB液体培养基中，置于摇床，37℃培养24h，观察细菌生长情况。

2.1.4 运动性观察

将分离的细菌接种到THB琼脂平板上，37℃培养18～24h，挑取单个菌落穿刺血清半固体培养基，置37℃恒温箱中培养24h，观察其生长情况。

2.1.5 生化试验

用灭菌的接种针取血液琼脂平板培养物接种于生化常规微量鉴定管，置37℃恒温箱中培养24h，观察其生长发酵情况。

2.2 动物试验

取小白鼠30只，10只/组，2组试验组（高剂量/低剂量），1组对照组。高剂量试验组每只小鼠皮下注射THB液体培养基菌液0.3ml，低剂量试验组每只小鼠皮下注射THB液体培养基菌液0.1ml，对照组每只小鼠皮下注射生理盐水0.1ml，观察小鼠死亡情况。

2.3 药敏试验

本试验采用药物纸片琼脂扩散法。药敏试纸选用滤纸，用打孔器打成直径6mm的圆片，经121℃15min高压灭菌后，于60℃下烘干备用。将滤纸片浸泡于配好的药液中，2h后取出，烘干，于4℃冰箱中保存备用。

2.3.1 菌液的配制

在超净工作台上，用接种环在酒精灯旁无菌挑取巴氏杆菌菌落1～2个，分别与3ml灭菌去离子水生理盐水充分混合制成巴氏杆菌悬液。

2.3.2 菌液的涂布与药敏纸片的放置

吸取THB液体培养基菌液，与生理盐水1∶1混合，配制200μl混合菌液，无菌涂布于哥伦比亚血琼脂培养基中，室温静置2～3min，用镊子小心夹取药敏纸片紧贴于培养基表面，37℃培养12h后观察结果。

2.3.3 药敏试验判定标准

培养24h后取出培养基，测量抑菌圈的直径大小。抑菌圈的边缘以肉眼看不到菌菌落明显生长为限。按照抑菌圈直径的大小判断菌株对药物的敏感性。一般抑菌直径＜10mm为耐药；抑菌直径10～15mm为低度敏感；抑菌直径15～20mm为中敏；抑菌直径≥20mm为高敏[8]。

3 试验结果及分析

3.1 涂片染色结果

组织触片或培养物涂片，革兰氏染色、观察，镜检，发现密集的两极浓染、革兰氏染色阴性的短杆菌，疑为巴氏杆菌；瑞氏染色镜检，可见两极浓染卵圆小杆菌。符合多杀性巴氏杆菌的形态特征。

3.2 细菌分离培养结果

在THB培养基上可见约2～3mm的光滑、隆起、灰白色、半透明、露珠样不溶血的小菌落；在麦康凯琼脂平板培养基上无明显菌落生长；三糖铁培斜面养基的斜面和底面都变黄，产气。从平板上挑起涂片，革兰氏染色，镜检革兰氏阴性，可见两端钝圆、两极浓染的椭圆形小杆菌，疑为巴氏杆菌。

3.3 运动性观察结果

一种菌在半固体血清培养基中细菌沿穿刺线生长说明，该菌无运动力，疑为巴氏杆菌。

3.4 生化试验结果

结果见表1可以看出，其符合巴氏杆菌特征。

表1 疑为巴氏杆菌生化反应结果

3.5 动物接种试验结果

接种后第12小时，试验组小鼠出现明显的精神沉郁等症状，对照组小鼠无明显变化。高剂量试验组小鼠接种后18h内全部死亡；低剂量试验组小鼠接种后24h内全部死亡，对照组小鼠健康存活。将致死小鼠逐一解剖，可见典型败血症症状，特别在皮下及肝、脾等脏器有明显出血点，对照组小鼠无明显出血症状。取致死小鼠肝、脾及血液涂片并用姬姆萨-瑞氏染色，均可见两极着色的短小杆菌。

3.6 药敏试验结果

从表2可以看出，分离菌巴氏杆菌对氟苯尼考、环丙沙星、氨苄西林等高敏；新霉素、呋喃唑酮、庆大霉素等中敏；青霉素、链霉素等低敏；对阿莫西林、土霉素等耐药。

表2 巴氏杆菌对药物的敏感情况（mm）

4 讨论

（1）随着抗菌药物的广泛应用和疾病治疗中超量不当使用抗生素，细菌极易对一种甚至多种抗菌药物产生耐药，并且到了难以控制的地步。出现了多重耐药菌株且耐药菌株广泛传播的局面。该水族馆出现该疾病后，曾用多种常用抗生素（如阿莫西林）治疗，但疗效甚微。试验结果也表明，分离出的病原菌对临床常用药物如链霉素等均表现出高度耐药性，且已严重影响到治疗效果和经济效益，为临床上治疗巴氏杆菌病带来很大困难。因此，切勿滥用抗生素，并且有必要在使用抗生素前最好先进行药敏试验，筛选出敏感抗生素，按该药的常规剂量和疗程使用[16]，为了防止耐药菌株的产生，临床上应交替使用敏感抗菌药物。

（2）多杀性巴氏杆菌广泛存在于自然界中。该水族馆企鹅发病，可能由于饲养管理不当，场所及饮食方面等多方综合原因引起。故在饲养管理时，应加强饲养环境消毒，尤其对饲养用具，彻底消毒，杀灭病原微物，减少感染疾病的途径，对企鹅活动的区域的护栏等设施认真修整，防止尖刺和铁丝尖刺伤企鹅。

（3）目前我国出现的多杀性巴氏杆菌感染多为禽源，以禽霍乱为主，由于我国不是企鹅的主要饲养国家，主要针对特定场所用于观赏，所以全国企鹅源性的巴氏杆菌报道几乎没有，当前，防治该病主要困难为抗生素滥用现象日益严重及饲养环境逐渐恶化，所以，加强平时饲养管理是防治本病的重中之重，加强平时管理要注意市场通风、定期消毒、适时扩群。加强免疫，针对禽霍乱，除特定疫苗外还可以使用蜂胶苗，在产蛋前1～2周使用，并配以抗生素的使用，本文通过药敏试验可以发现，分离自企鹅体内的多杀性巴氏杆菌对氟苯尼考、环丙沙星、氨苄西林等高敏；新霉素、呋喃唑酮、庆大霉素等中敏；青霉素、链霉素等低敏；对阿莫西林、土霉素等耐药。因此，除加强管理，及时免疫外，还要根据药敏试验指导，合理使用抗生素，切勿滥用抗生素，可有效防治本病的发生。