甜菜褐斑病及种质资源抗性研究进展

邹锋康，丁广洲，贾海伦，陈丽

（1.黑龙江省甜菜工程技术研究中心/黑龙江大学，哈尔滨150080；2.国家糖料改良中心/黑龙江大学，哈尔滨150080；3黑龙江省高校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）是当今世界种植面积仅次于甘蔗的糖料作物，是世界主要的制糖原料之一，提供着世界上大约25%的蔗糖需求[1]。甜菜褐斑病（Cercosporaleaf spots，CLS）是由甜菜尾孢菌（Cercospora beticolaSacc.）引起的真菌病，是影响甜菜产量的一种世界性病害，在各甜菜种植国均有发生。为了控制甜菜褐斑病的发生，国内外科学家做了大量的研究工作，如：Vaghef等发表了甜菜尾孢菌种群的多样性、致病性和进化物种界限[2]。Piszczek等报道波兰甜菜尾孢菌对化学药物的抗性增强[3]。Mahdi Arzanlou等发现尾孢菌拮抗菌可以抵抗尾孢菌病害[4]。Kazunori等利用复合区间作图发现了4个与CLS抗性相关的QTL[5]。王茂芊等对国内外18个甜菜品种做了根腐病和褐斑病抗性鉴定[6]。丁广洲等对甜菜褐斑病抗感种质细胞超微结构变化进行了比较[7]。杨安沛等进行了不同甜菜品种对褐斑病的抗性分析[8]。前人还对褐斑病菌及褐斑病发病机制[9]，褐斑病菌的抗药性[10]和甜菜对褐斑病抗性[11]的研究动向分别做了总结。为了使人们更加清晰完整地了解近些年科学家对甜菜褐斑病的研究现状。本文综述了甜菜褐斑病菌的分类及其形态特征；褐斑病的发生、防治及致病机理；尾孢菌的抗药性；甜菜对褐斑病的抗性；甜菜抗褐斑病的遗传研究，以期为甜菜褐斑病的抗性研究和防治提供理论参考。

1 甜菜褐斑病菌的分类及形态特征

甜菜褐斑病菌为真菌界，半知菌亚门，不完全菌纲，丛梗孢目，尾孢科，甜菜尾孢菌属[12]。在属的分类上甜菜尾孢菌比较混乱[13]，原因可能是甜菜尾孢菌没有已知的端粒形态和菌丝连接及难以捉摸的交配系统。甜菜尾孢菌菌丝体基质发育不健全，直径达60 μm，内表皮或亚表皮层为棕色至深棕色。分生孢子梗2～18枚，束状，稍发散，棕色，顶端变浅，中等厚壁，圆柱形，宽度基本一致，简单，膝状，16～200 μm×4～6 μm，1～6隔，顶端截形，有时隔膜处收缩。分生孢子的细胞顶生或具有间隔，增殖合生，具1～2个位点；位点处明显增厚，不突起，顶端或分生细胞肩胛的形成是由膝状体外侧引起的，2.5～3 μm。分生孢子，丝状至针状，中等弯曲，很少具圆柱状，在基部截形，顶端锐尖至亚急状，27～250 μm×2～5 μm，3～28分隔[14]。

2 甜菜褐斑病的发生及其危害

甜菜尾孢菌在无性状态下，以假基质的形式在受感染的植物碎片上越冬，并通过雨水的飞溅使分生孢子短距离传播[15]。其可从甜菜叶片两侧对叶片进行侵染。其侵染过程分为两类：一种为附着在叶片表面的尾孢菌分生孢子或分生孢子分支通过植物气孔开口进入植物细胞间隙，在细胞间隙中吸取植物组织中营养，不断生长形成菌丝团，同时分泌一些有害物质对周围植物组织细胞造成破坏，使组织塌陷，形成褐色斑点[16]；另一种为分生孢子破坏细胞表皮对植物细胞进行侵染,在细胞表皮下，分生孢子产生大量短细胞，短细胞在细胞间隙不断生长破坏周围细胞，造成组织细胞塌陷，形成棕色斑点[16]。

在温度20℃左右，湿度70%以上，无风条件下甜菜褐斑病容易发病。在每年6月下旬到7月上旬开始发病，7月到8月为盛期，9月中旬停止蔓延[17]。发病由老叶开始，然后是幼叶。发病初期在叶部表现为叶表面出现很多针尖大小的褐色小斑点，之后斑点逐渐扩大，呈圆形、椭圆形或不规则的轮廓，最后，叶片病斑连成大片，造成叶片的干枯脱落。在一般年份，该病可造成甜菜块根减产10%～20%，含糖降低1～2度，叶茎损失40%～70%[18]。

3 甜菜褐斑病的防治

目前，还没有育出完全抗褐斑病的甜菜品种，甜菜褐斑病仍然是影响甜菜产量的一个重要因素。人类对甜菜褐斑病的防治措施主要包括：褐斑病的早期鉴定、生物防治和化学防治。

3.1 褐斑病鉴定

褐斑病鉴定是预防褐斑病发生的一个重要手段。以前鉴定是通过肉眼观察鉴定评价的，这种方法对褐斑病早期侵染无法识别，对中期染病级别判断不准确，且具有一定的主观性。随着科学技术的不断发展，分子鉴定和生理指标鉴定逐渐走向成熟，其以快速、灵敏、准确的优势逐渐代替了肉眼鉴定。目前褐斑病鉴定的方法有：Andreea-Mihaela BALAU等[19]以聚合酶链反应（PCR）为基础，提出了一种鉴定甜菜尾孢菌早侵染的方法。该方法把甜菜叶片DNA纯化后，将匀浆中的片段加入到PCR反应中，并利用尾孢菌基因特异性进行扩增。扩增产物的片段大小与从尾孢菌培养物中提取的DNA片段大小相关联，以鉴定真菌。Rumpf等[20]建立了一种基于支持向量机和光谱植被指标的甜菜褐斑病早期检测和鉴别的方法，对甜菜健康叶片和病叶的分类准确率达到了97%。Arens等[21]研究表明高光谱成像对甜菜褐斑病感染预测准确率可达到98.5%～99.9%。Lartey等[22]提出了一个快速检测甜菜组织中甜菜尾孢菌的PCR方法。Bma[23]等用图像分析软件和实时PCR方法，对甜菜不同阶段褐斑病病变和病菌生物量进行定量检测，该方法可用于褐斑病早期感染的鉴定和评估，为高效准确鉴定褐斑病提供了一种手段。Leucker[24-25]等和Roscher[26]等研究表明高光谱成像能通过客观、精确的植物表型鉴定，快速可靠地区分CLS的动态和病变。RongZhou等[27]研究表明鲁棒模板匹配和模式识别技术可以对田间甜菜叶斑病进行监测。

3.2 生物防治

生物防治是利用生物间的拮抗作用防治目标病害的一种方法。其简单、高效、对环境友好且对病害的控制成本较低，是病害防治的绿色良药。目前对甜菜褐斑病生物防治的研究已开展的较多了，Mahdi Arzanlou等[4]研究发现，尾孢菌拮抗菌可明显降低褐斑病的危害程度。史应武等[28]研究发现，多粘芽孢杆菌对甜菜褐斑病有抑制作用，且对甜菜的生长有促进作用。Douglas PCollins等[29]研究发现，枯草芽孢杆菌可以降低甜菜褐斑病的发病程度。AMH Esh等[30]从甜菜叶球中分离出16株淀粉酶芽孢杆菌，利用其对甜菜褐斑病病原-甜菜尾孢菌的拮抗活性进行了研究，结果表明，该菌株对甜菜褐斑病菌有明显的拮抗作用，对甜菜褐斑病菌径向生长的抑制率为77.8%～90%。S Galletti等[31]研究发现，木霉可减少尾孢菌的发生和孢子的产生，可作为甜菜褐斑病的生物防治剂。Caesar-Tonthat等[32]研究表明，担子菌真菌能降低尾孢菌素对微生物和植物组织的毒性作用。El-Fawy[33]研究发现青霉对尾孢菌有抑制作用，其抑制作用与粘合剂浓度有关。

3.3 化学防治

化学防治是目前最普遍、有效的方法。目前甜菜褐斑病防治的杀菌剂有两类：一类是保护性杀菌剂包括二硫代氨基甲酸盐，有机锡类等；第二类是吸纳性杀菌剂包括苯并咪唑类，甾醇脱甲基化酶抑制剂和甲氧基丙烯酸类等[34]。Ricardo[35]等研究发现，喷施壳聚糖或亚油酸-s-甲基可以降低甜菜褐斑病病害。Elkholi[36]利用氯化钙和螯合钙降低尾孢菌对甜菜的病害，取得显著效果。Nielsen等[37]研究发现2，6-二氯异烟酸（INA）可以使甜菜防御系统更快地被激活，增强甜菜的抗病能力。

4 甜菜褐斑病菌的耐药性

虽然杀菌剂在防治甜菜褐斑病发生上有很好的效果。但是，近些年人们发现杀菌剂的频繁使用会导致植物病原菌的选择性压力和抗药性的增强[38]。经过研究，科学家已证实尾孢菌的抗药性。Malandrakis等[39]研究表明，甜菜尾孢菌抗性突变株降低了尾孢菌对Qo敏感性。Piszczek等[3]研究表明，波兰甜菜尾孢菌QoI耐受性逐渐增强，所有耐药菌株均含有单鸟嘌呤取代(G/C)，预测甘氨酸在143个密码子位置（G143A）可转化为丙氨酸。Budakov等[40]对塞尔维亚甜菜尾孢菌进行耐药性研究。研究表明，该地的菌株对粉唑醇和多菌灵的耐药率分别为16%和96%。且所有对粉唑醇耐药的菌株对多菌灵也都是耐药的。Trkulja等[41]（2008—2011）对塞尔维亚两个地区的甜菜田使用判别浓度法，研究确定收集的93.3%～98.6%甜菜褐斑病分离菌株对MBC杀菌剂具有抗性，而6.2%～42.4%甜菜褐斑病分离菌株对DMI杀真菌剂具有抗性。Kirk等[42]研究表明，美国密歇根州和内布拉斯加州的甜菜尾孢菌对杀菌剂具有抗性。Nikou等[43]从重喷三唑醇的希腊甜菜田中分离出甜菜孢菌菌株。鉴定了两个抗性表型，抗性因子分别为18～25和65～115。Rosenzweig等[44]研究表明，美国密歇根州的尾孢菌对对苯二酚外抑制剂（QoI）和苯并咪唑类杀菌剂有抗性。Trkulja等[45]研究发现尾孢菌对MBC、DMI和QoI三种杀菌剂表现出较强抗性。Vaghefi等[46]研究美国（纽约）甜菜分离株发现，f129l突变使尾孢菌获得了中度的QoI抗性。尾孢菌的的抗药性变异，已成为世界各甜菜种植国面临的棘手问题。目前，主要的应对措施是几种杀菌剂交替使用，以防止单一用药的选择压下耐药菌株的产生。Obuya等[47]研究发现美国中部高原区白尾孢菌对甲氧基丙烯酸酯有抗性，PCR-RFLP检测方法能可靠、灵敏、快速检测尾孢菌的抗药性。

5 甜菜抗褐斑病的相关研究

5.1 甜菜对褐斑病的抗性

植物中存在多种多样的防御机制，包括先天防御，如物理屏障和组成性表达的抗菌剂A、C、B化合物和诱导性耐药机制如超敏反应和系统抗性。宿主/病原体相互作用的组织学研究揭示了病原体入侵后植物的各种防御反应[48-49]。研究表明甜菜的尾孢菌抗性可能与气孔的开关频率、直径或水压刺激的强度等特性有关[50]；甜菜受尾孢菌侵染后叶片中的酚类化合物、多酚氧化酶、过氧化物酶的活性、葡聚糖酶、胼胝体、果胶、木质素和角质蜡含量的增加[51-58]，使尾孢菌菌丝体在叶肉细胞的发育受到限制。

Hecker[59]等研究发现，氨基酸Glu和DOPA可能与甜菜褐斑病的抗性有关。Glu可能增加易感性，DOPA可能在抗病机制中发挥作用。Johnson等[60]研究发现，褐斑病菌在侵染甜菜叶片时叶片3-羟基-7,8,4'-三甲氧基黄酮（C18H16O6）和黄曲霉毒素（C17H12O6）的含量升高且高抗株比敏感株含量要高。表明这两种化合物在抗褐斑病中起重要作用。Arens等[21]研究发现多巴胺，12-羟基茉莉酸-12-O-尾-D-葡萄糖苷，泛酸和5-阿魏基奎尼酸和甜菜尾孢菌抗性有关。Anne等[61-62]研究发现甜菜细胞间抗真菌蛋白（IWF6）与甜菜褐斑病抗性有关；甜菜叶片中的非特异性脂质转移蛋白（Nsltp）对甜菜尾孢菌有较强的抗性，在浓度低于10 μg/mL的情况下抑制真菌生长。

5.2 甜菜抗褐斑病遗传研究

甜菜对褐斑病的抗性遗传既有加性效应又有非加性效应。Ourazizadeh等[63]研究表明加性和非加性遗传效应都有助于褐斑病抗性的表达，但基因的加性比非加性遗传效应更为显要，因为隐性基因对褐斑病的抗性有一定的控制作用。Niazian等[64]的研究也表明，加性遗传和非加性遗传成分对控制褐斑病的抗性都有一定的贡献，但加性基因效应比非加性基因更重要。Lewellen等[65]研究甜菜对尾孢菌生理小种C2的遗传特征时发现，甜菜对生理小种C2的抗性是由一个显性基因决定的，抗性等位基因对生理小种C1的反应无影响。

5.3 甜菜抗褐斑病基因的研究及其QTL定位

多基因遗传抗性的数量性状位点（QTL）定位是分析寄主植物连锁图上遗传抗性因子数量和位置的有力工具[66]。甜菜对尾孢的抗性是多基因定量控制的，形成抗性的宿主基因的确切数目仍不清楚。1970年Smith和Gaskill对甜菜褐斑病遗传抗性的研究表明，在所使用的杂交组合中，有4～5个主要抗性基因参与了褐斑病抗性的表达[67]。Schondelmaier等[68]对甜菜抗褐斑病基因做了QTL的染色体定位。Nilsson等[69]利用110个AFLP和35个限制性片段长度多态性（RFLP）标记对193个分离群体的数量性状位点（QTL）进行了分析，研究甜菜褐斑病抗性的遗传规律。分别在连锁群1、2、3和9上进行复合区间定位，发现5个QTL，其中2个位于连锁群3上。Schafer-Pregl等[70]在6个染色体上发现了7个与褐斑病相关的QTL。Setiawan等[71]利用复合区间作图法，在Ⅲ、IV、VII和IX染色体上，发现了4个与褐斑病抗性相关的QTL。Koch等[72]在3个染色体上发现了4个与褐斑病相关的QTL。Kazunori[5]等利用复合区间作图（Cim），在III、IV、VII、X上发现了4个与CLS抗性相关的QTL。Taguchi等[73]对RILs和Nils群体进行了QTL分析，并用人工接种的方法对褐斑病抗性进行检测，从NK-310 mm-O中检测到两个与抗褐斑病相关的QTL。

5.4 甜菜抗褐斑病基因的克隆与利用

基因工程育种是现代抗病育种的一个重要手段，运用抗病基因，育种家在很多作物上都已育成了抗病性优良的品种。抗病基因克隆是基因工程育种的一个重要环节，只有发现并克隆出抗病基因我们才能培育出更加优良的抗性品种。目前甜菜抗褐斑病基因的克隆和利用研究开展的较少：刘大丽等[74]对甜菜抗性基因AtChitinase1和AtChitinase2进行了克隆，获得了两个抗褐斑病基因。Upchurch等[75]以根瘤菌为载体，在甜菜中（Beta vulgarisL.）中克隆表达了基因CFP，并验证基因CFP能增强对抗褐斑病的抗性。Kuykendall等[76]利用转化法已经成功构建了具有抗褐斑病基因CFP的甜菜。Xin-Yu[77]等对第一代转RIP基因甜菜的抗褐斑病性和生理特性进行了研究。结果表明，RIP基因能提高甜菜的抗褐斑病能力，对甜菜的生长和生理代谢无不良影响。Stahl等[78]利用其发明了转基因方法产生的转基因甜菜对褐斑病有很好的抗性。

6 展望

目前，化学药物防治是甜菜各种植国甜菜褐斑病防治主要的手段。化学药物防治虽然成本相对较低，但是对土壤及生态环境的污染较为严重，影响人类的身心健康，也易加快病菌的进化速度，产生抗药病菌。生物防治和抗病育种是防治褐斑病最为健康的防治手段。生物防治顺应自然进化法则，利用物种间的拮抗作用以一种非致病生物抑制目标生物的生长，使得破坏维持在一个稳定的范围，在不破坏物种多样性和和生态环境的前提下，使人们得到最大的收益。抗病育种是科学家利用传统和基因工程手段，把植物与病菌长期斗争中进化出来的抗性遗传基因进行收集和利用，使那些抗病性低的种质抗性普遍增加。因此，生物防治和抗病育种将是未来的主要研究方向。

虽然很多科学家已经对甜菜抗褐斑病基因进行QTL定位，但是目前克隆出的抗褐斑病有效基因还很少。甜菜抗褐斑病育种需要把与褐斑病抗性有关的基因克隆出来，具体研究其在甜菜抗病过程中发挥的作用，把整个过程数字化，这样科学家才能灵活掌握各个环节，培育出更加优良的品种。因此，褐斑病抗性相关基因的寻找和克隆将是未来研究的重要课题。