超声靶向破坏微泡技术在糖尿病肾病基因治疗中的应用进展

杨丽飞 王萍 马苏亚

糖尿病肾病（DN）是导致糖尿病患者死亡的主要并发症之一[1]。目前临床上对于DN治疗仅能够延缓其进展，并不能完全阻止或逆转疾病病程。有基础研究通过建立DN动物模型并针对肾脏炎症、纤维化和氧化应激等多种分子途径进行模拟治疗，疗效不明显[2]，故开拓新的治疗方法仍是当前DN基因治疗的研究热点，而超声靶向破坏微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一种安全且高效的治疗手段为DN基因治疗提供了新思路，本文就UTMD技术及其在DN基因治疗中的应用研究进展作一综述。

1 DN的基因治疗

基因治疗是一种具有广泛前景的靶向性生物治疗手段，用于治疗包括DN在内的各种疾病。与药物治疗所提供的短期效果不同，基因治疗可以提供更为持久的治疗效果，其针对性强、不良反应小。

Steven等[3]为了探究AC261（一种高选择性视黄酸受体β2激动剂）在高脂喂养DN小鼠模型中的治疗作用，予模型小鼠AC261治疗12周后发现，DN小鼠耐受性良好且无明显不良反应。与单纯高脂喂养的DN小鼠相比，AC261治疗后的高脂喂养DN小鼠血糖控制改善，蛋白尿和尿白蛋白与肌酐比值降低；且在该组小鼠中，DN的许多细胞特征有所改善，包括肾小管脂滴减少，内皮细胞塌陷、系膜扩张和肾小球基底膜增厚情况好转。此外，经超微结构和免疫组化分析显示，经AC261治疗后的小鼠足细胞足突和裂隙膈膜形态保持，足细胞裂隙膜蛋白和转录因子WT1水平升高。上述结果说明AC261在高脂喂养DN模型小鼠的治疗中起积极作用。Wang等[4]使用肾近端小管特异性p53敲除和pifithrin-α（p53抑制剂：PIF）治疗的糖尿病小鼠模型研究了p53抑制DN肾纤维化的作用，发现在人肾小管上皮细胞中，PIF对p53的抑制降低了高糖诱导细胞外基质积累，逆转了高糖对lncRNA锌指E-box结合同源框1-反义RNA 1（ZEB1-AS1）和ZEB1 mRNA表达水平的抑制作用。上述发现也通过DN患者肾活检标本得到验证。说明肾近端小管细胞中p53的药理抑制和基因缺失可以减轻链脲佐菌素（STZ）诱导的DN小鼠肾功能障碍、小管上皮细胞破坏和间质纤维化，表明p53可能是DN肾纤维化的治疗靶点。

然而，缺乏安全有效的基因运输途径限制了基因疗法应用于DN临床试验。虽然病毒载体的转染效率高，但是它存在诱导免疫反应、致癌等临床问题。因此，寻找安全、有效且高度靶向的基因载体是推进基因治疗应用于临床的关键。

2 UTMD技术的应用研究

2.1 UTMD作用机制 UTMD 是一种新兴的靶向药物与基因转运方法，是目前公认的靶向介导基因转染和药物运输的有效方法。UTMD是指在超声介导下可实现微泡携带药物的靶向释放或通过微泡的靶向破坏使病灶区域药物聚集，增加病灶区域药物的靶向释放，提高药效并减少药物全身不良反应。

UTMD技术及靶向转运机制主要是在超声介导下微泡产生的空化效应及声孔效应[5]。空化效应则指当介质中微泡暴露在超声辐照下，随着超声频率的变化产生周期性“膨胀-压缩”。在低强度声场中，微泡在细胞附近缓慢均匀振动，产生微流、微喷射等声学效应，这种空化效应可导致细胞膜渗透性增加或细胞膜损伤，并且在细胞膜表面形成许多大小不等、数量不一的小孔，即声孔效应[6]。空化效应及声孔效应可以促进基因和药物进一步外渗、渗透和细胞吸收。

2.2 UTMD与基因治疗 超声介导的基因传递是一种非侵入性的基因靶向转染方法，可用于传递病毒和非病毒载体。超声微泡造影剂是一种非病毒载体，与其他非病毒基因转染方法相比，其制备简单、载基因量大、转染率高且无免疫原性，可重复使用且安全性高。

UTMD技术为心血管疾病的治疗提供了一种非侵入性和非病毒载体的方法，可以有效地将质粒运送到目标区域。有学者为了研究抗凋亡基因survivin在心力衰竭中的治疗作用，通过建立由多柔比星诱导的大鼠心力衰竭模型并联合UTMD技术进行survivin靶向转运的抗凋亡基因治疗[7]。通过PCR、免疫组织化学、超声心动图和侵入性血流动力学检查并分析发现，UTMD联合survivin治疗模型大鼠左心室短轴缩短率显著升高；此外，实验组TUNEL和caspase活性的降低以及心肌间质纤维化的减少提示心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡减少。上述实验说明协同UTMD技术为心血管疾病的治疗提供了一个有效治疗方法，利用超声微泡为非病毒载体进行基因的靶向转染可以增强维持心脏功能和恢复缺血心肌供血的必须因子。

近年来，UTMD介导的基因治疗肿瘤领域应用愈发广泛，如在肝细胞肝癌、鳞状细胞癌、肾癌等治疗方面均获显著效果；三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性乳腺癌，由于缺乏孕激素受体、雌激素受体和HER2的表达，其复发率比其他乳腺癌亚型显著增高，总体生存率也显著缩短。为提高TNBC的治疗效果，Sun等[8]研制了一种新型的多功能阳离子卟啉接枝脂质微泡并载有低氧诱导因子1α（HIF-1α）siRNA。这种微泡载药量高且药物提前释放少，通过实时超声成像可以轻松监控微泡的分布。此外，通过联合UTMD技术，该微泡可以在原位高效转化为纳米颗粒，通过空化效应促进卟啉和siRNA在肿瘤部位的积累。HIF-1α siRNA可以下调HIF-1α水平，进而增强光动力疗法疗效以及部分抑制肿瘤发展。因此，UTMD联合光动力疗法和基因治疗被认为是TNBC有效的治疗策略。

除心血管、肿瘤领域外，UTMD介导的基因治疗亦在其他领域扮演重要角色。Xiang等[9]为了研究经UTMD介导的胰岛素样生长因子1（IGF-1）cDNA和转化生长因子（TGF-β）短发夹RNA转染对大鼠跟腱损伤的保护作用。治疗后发现，IGF-1+TGF-β+UTMD组模型大鼠黏附指数得分最低、炎症程度最轻、4，6-二氨基吲哚核计数信号最高、IGF-1表达最高以及TGF-β表达最低；UTMD组比无UTMD组具有更高的转染效率，且该组的模型大鼠最大荷载和拉应力均大于其他组。总之，IGF-1和TGF-β联合应用UTMD是一种有前途的体内肌腱损伤治疗方法。

UTMD技术所介导的基因治疗为各种疾病的治疗焕发了新的活力，因其安全、无创、高效且使用简单应用越来越广泛，也因微泡与超声相结合所产生的独特效应使得特定区域病灶的成像与治疗一体化，真正做到了同时监测疾病进展并予以治疗的效果。

3 UTMD在DN基因治疗中的应用

UTMD作为一种新进基因转染介导技术，为DN基因治疗提供了一种新思路[10-25]。TGF-β/MAD的同系物（SMAD）和NF-κB信号通路在DN炎症及肾纤维化的发展中起关键作用。Chen等[10]研究Smad7在STZ诱导的DN小鼠模型中的保护作用时发现，经UTMD介导的Smad7转染可显著降低DN小鼠微量白蛋白尿，减缓了TGF-β/Smad3信号通路介导的肾纤维化以及NF-κB/p65信号通路介导的肾脏炎症反应的进展。随后，Ka等[11]进一步确定通过UTMD技术协同Smad7基因治疗能够明显抑制db/db小鼠糖尿病肾损伤，且实验证明通过过表达Smad7所改善的2型糖尿病肾损伤与显著抑制肾脏中TGF-β/SMAD和NF-κB信号通路的激活有关。该研究结果清楚地表明利用UTMD技术联合肾靶向Smad7基因转染可以通过同步调节TGF-β/SMAD和NF-κB信号通路来治疗2型DN。

近年来发现骨髓间充质干细胞（MSCs）在多种肾脏疾病中的修复中扮演重要角色，Marcelo等[12]也证实了可以通过体外MSCs移植控制DN发生、发展。然而经静脉移植的MSCs在DN肾脏中检出率很低且难以到达病变组织，这在极大程度上阻碍了MSCs对损伤肾脏的治疗作用，限制了干细胞治疗的有效开展。张翊等[13]发现通过联合UTMD技术可以促进静脉移植MSCs肾靶向归巢从而对DN大鼠产生治疗效果。结果表明通过外源性MSCs移植可以减轻肾小管和间质损害，而联合UTMD技术可以促进MSCs迁移、归巢至肾间质，强化MSCs治疗效果。此外，该团队通过进一步实验证明UTMD可增加早期DN大鼠肾间质毛细血管通透性且无出血坏死等不良反应，提示UTMD可能是促进药物、基因、抗纤维化药物或干细胞进入肾脏的一种有效且安全的治疗方法[14]。骨髓MSCs（BMSCs）的迁移和存活主要取决于局部肾脏微环境中的炎症反应。Wang等[15]证明适当微泡介导的超声辐照可引起肾脏微环境的改变，进而促进BMSCs对糖尿病肾脏的归巢能力，且不会引起肾毒性和细胞损伤。

研究发现，基质细胞衍生因子（SDF-1）与其特异性受体CXCR-4可以促进MSCs靶向归巢，且能增加MSCs在体内的生存效率、抑制MSCs凋亡等作用，从多方面提高MSCs的靶向治疗效果[16]。吴盛正[17]通过将SDF-1与微泡共价连接，经静脉注射并通过超声靶向爆破释放SDF-1至DN大鼠模型左侧肾脏。与正常大鼠相比，DN大鼠接受UTMD处理后靶向释放SDF-1后24h MSCs对DN肾脏的靶向归巢显著改善。随后，王龚[18]使用UTMD协同脂质体诱导CXCR-4基因转染进入BMSCs，并经静脉移植入DN大鼠肾脏并联合超声辐照。结果发现，载CXCR-4质粒可以成功转染和表达于细胞且联合UTMD技术协同脂质体可以显著增加CXCR-4基因在外源BMSCs的转染效率。此外，联合UTMD技术能够增加CXCR-4所修饰BMSCs靶向归巢DN大鼠肾脏的效率，进一步通过抑制TGF-β1和TNF-α的表达从而改善DN大鼠肾功能。UTMD技术可以利用超声辐照或协同其他介质增加静脉移植BMSCs在糖尿病肾脏的靶向归巢效率并提高DN的治疗效果，该技术为今后DN预防和治疗提供了一种无创、安全且高效的新方法和新思路。

研究表明在体外条件下，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白（CTLA-4-Ig）可通过对抗高糖环境进而恢复足细胞的生理结构和活性，且进一步实验证明CTLA-4-Ig可改善甚至消除DN大鼠体内蛋白尿的发生[19]。邹春鹏[20]研究发现经UTMD技术联合CTLA-4-Ig可进一步改善DN大鼠肾脏功能，提高该基因原有的生物学效应。Kallistatin（KS）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗炎、抗血管生成和抗氧化的特性，而氧化应激在DN的发生、发展中占据重要地位。Yiu等[21]发现经UTMD技术诱导DN小鼠肾小管内KS过表达可通过多种机制包括抑制氧化应激、抗纤维化和抗炎作用、降低血压等对DN起肾保护作用。

研究发现，microRNA在DN发生、发展中起调控作用，这使它成为目前UTMD介导的基因靶向转染中的研究热点。Zhong等[22]利用UTMD技术将microRNA-21敲除的质粒转染到10周龄db/db小鼠的糖尿病肾脏中并予以治疗10周发现，DN小鼠肾脏Smad7表达维持正常水平且TGF-β和NF-κB信号通路的激活受到抑制；DN小鼠的肾脏功能改善、肾脏炎症、微量白蛋白尿和纤维化减少。MicroRNA-29b是TGF-β/Smad3信号通路所诱导纤维化的下游抑制剂，可作为纤维化的生物标记物，由此推测该基因具有治疗DN的潜力。Chen等[23]通过联合UTMD技术转染稳定表达microRNA-29b质粒至DN小鼠肾脏并升高肾脏其表达水平，发现microRNA-29b能够抑制TGF-β所诱导的纤维化和NF-κB诱导的炎症反应，从而减轻DN症状。

王艳等[24]为了研究UTMD联合连接SelS基因的携P-选择素单抗靶向微泡（SMBp）对早期DN的治疗效果，构建了2型糖尿病雄性SD大鼠模型。通过对各组大鼠空腹血糖、24h尿蛋白、β2微球蛋白水平等生化指标及AngⅡ、TGF-β1、P-选择素、SelS 的表达水平进行检测发现，超声+SMBp组大鼠上述检测指标均显著低于对照组、单纯 SelS组、SMBp组，治疗效果均优于上述组别。上述结果表明连接SMBp联合UTMD治疗早期DN有显著疗效，是作为防治早期DN的有效手段之一。

Ting等[25]构建雄性SD大鼠早期DN模型，通过将CoQ10与脂质体组装成CoQ10-脂质体（CoQ10-lip），并利用UTMD技术对早期DN模型大鼠进行治疗，同时评价模型大鼠肾脏的形态和功能。实验结果表明，经CoQ10-lip联合UTMD治疗后，大鼠肾血流动力学明显改善，其中24h尿蛋白降低、氧化应激指标相应调节提示肾功能恢复。由此可见，CoQ10-lip和超声微泡的结合对受损肾脏的保护效果也优于其他对比组。这也提示CoQ10-lip联合UTMD对于逆转早期DN的可行性。

综上所述，UTMD技术联合基因治疗为DN治疗的临床开展提供了充分的可能性，也为DN的基因治疗尽早应用于临床打下坚实基础，更为广大糖尿病患者早日克服DN困扰带来福音。

4 问题与展望

UTMD介导的基因转运在DN的基因治疗中扮演重要角色，动物水平已证明其可以提高基因在DN肾脏中的转染效率，能满足作为非病毒基因载体的生物学特性需求。但DN基因治疗在运用于临床前仍有许多问题等待解决，例如：（1）如何寻找有效的DN靶向基因以及调控DN发生、发展的信号通路，并以此寻找针对性治疗方案；（2）如何增加超声微泡的载药率及运输途中的损失率；（3）如何降低靶向爆破超声微泡所引起的组织出血、血管内溶血，热效应以及组织损伤等不良反应。

总之，基因治疗有潜力成为一种对抗DN的有效武器，而UTMD技术介导的靶向基因治疗具有安全、有效、无创且可重复性高等多种优点，是进一步促进DN基因治疗早日应用于临床的强有力辅助手段。