缺血预处理对神经保护作用的晚期基因管理机制研究进展

2019-01-05

中西医结合心脑血管病杂志 2019年9期

早在1986年，Murry等[1]首次在犬心肌缺血的实验模型中观察到缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)的保护效应。对麻醉犬给予4次单独的分别为5 min的局灶缺血处理，随后予以冠状动脉闭塞40 min后再灌注，心肌梗死面积较假手术组降低75%，提示缺血预处理对缺血脏器具有保护作用[2]。1990年，Kitagawa等[3]首次在沙土鼠脑缺血实验研究中观察到缺血预处理的神经保护效应。对沙土鼠颈动脉血流给予两次2 min阻断后再灌注的预处理，2 d后予以更严重的5 min血流阻断后再灌注，与未予以预处理的沙土鼠相比，海马CA1区锥体细胞神经元的死亡明显减少。随后的多项研究证明，缺血预处理同样具有抑制神经元凋亡、促进梗死区域血管生成、缩小脑梗死体积、减轻脑水肿、改善认知功能等中枢神经系统保护作用。现就缺血预处理神经保护机制的中晚期基因管理机制的研究进展进行综述。

1 晚期基因管理的神经保护机制

1.1 低氧诱导转录因子(hypoxia-inducible transcription，HIF)及其靶基因的调节 HIF-1是蛋白质合成的关键调节因子。已发现低氧预处理(hypoxic preconditioning，HPC)增加新生动物和成年动物脑组织中HIF-1的表达[4]。HIF-1、HIF-2和HIF-3均由α和β亚基组成，并且是碱性螺旋-环-螺旋-PAS超家族的成员。在生理条件下，HIF-1α被脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)家族羟化，进一步通过泛素化修饰降解。然而，低氧预处理通过抑制其中脯氨酰羟化酶-2(prolyl hydroxylase-2，PHD-2)的活性，抑制HIF-1α的降解，增加HIF-1α的功能。因此，在低氧条件下，HIF-1α逃避PHD-2对其的分解作用，转而移位至细胞核与HIF-1β结合形成二聚体，与靶基因上的低氧反应元件结合，激活下游数十个基因的转录作用，其中促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[5]作为重要的下游蛋白在低氧预处理中发挥着重要作用。Qiao等[6]报道通过间歇性缺氧实验建立高海拔环境模型小鼠，与对照组小鼠相比，可诱导HIF-1表达增加，在随后3支血管闭塞引起的脑缺血后，表现出更强的认知功能。而加入HIF-1抑制剂则可完全阻断HIF-1的生成及预缺氧的保护作用。以上结果显示，HIF-1的连续激活，是缺氧预处理加速小鼠脑缺血后认知功能恢复所必需的。

1.2 促红细胞生成素 EPO过去认为是胎儿肝脏和成人肾脏中广泛产生的造血因子，现证实星形胶质细胞和神经元中也有EPO合成[7]。在脑缺血和创伤的动物模型研究中，证实EPO能减少缺血损伤，发挥脑保护作用。由于EPO属于大分子物质，难以通过血脑屏障，所以内源性EPO的产生对脑保护很重要。EPO在脑中通过其基因3′端的低氧反应元件(hypoxia response elements，HREs)以低氧敏感的方式释放。尽管EPO受体(EPO-R)基因的转录不被HIF-1调控，但低氧状态确实诱导了EPO-R在神经元细胞中的表达增加，同时增强了细胞对EPO的敏感性。缺乏EPO或EPO-R的小鼠在发育过程中神经细胞凋亡增加[8]。

重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)通过基因重组技术合成，其氨基酸序列及生物学活性与天然EPO完全一致。Sola等[9]研究表明，rhEPO 在体外可以诱导酪氨酸激酶JAK2磷酸化，且在急性全脑缺血的新生大鼠模型中激活了JAK2。在慢性脑缺血时，rhEPO可以减少神经元凋亡，改善长期脑灌注不足大鼠的认知功能，外源性地给予JAK2 特异性抑制剂AG490，可以抑制这一神经保护作用，推测该神经保护作用可能与激活JAK2/STAT3通路有关。

1.3 血管内皮生长因子 VEGF是由肾、睾丸、肺、肝、心脏和脑组织缺氧而产生的重要信号蛋白。VEGF可由平滑肌细胞、黄体细胞及肾上腺皮质细胞等产生和分泌。研究证实，在脑缺血再灌注后VEGF可在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中表达[10]。VEGF刺激内皮细胞以促进血管再生[11]，是血管增殖过程中高特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的因子[12]。 Tischer等[13]从人类基因编码区发现VEGF 3种亚型，分别由189、165和121个氨基酸组成。VEGF的生物学效应主要由两种酪氨酸激酶受体Flt1(VEGFr-1)和KDR(VEGFr-2)介导[14]。动物模型显示，给予缺氧预处理后，成年小鼠脑中VEGF表达明显升高[15]。Laudenbach等[16]通过实验证实，加入抗VEGFr1/2单克隆抗体可抑制缺氧预处理的神经保护效应。同时，缺乏低氧反应元件的VEGF基因突变小鼠，与野生型同窝出生仔猪相比，缺氧预处理未体现出神经保护效应，反而加剧了脑损伤。以上试验表明，HPC通过VEGF/VEGFr1/2途径发挥神经保护效应。

1.4 诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 线粒体功能障碍在缺血再灌注损伤中起重要作用，一氧化氮(NO)作为一种自由基通过修饰线粒体功能，介导缺血再灌注损伤后的细胞保护作用。NO的产生由氧化还原酶一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)介导，NOS有3种亚型：神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)、免疫或诱导型NOS(iNOS)。Cho等[17]利用脂多糖或短暂性前脑缺血进行预处理发现，无iNOS的小鼠不会产生对局灶性缺血的耐受性，提示在预处理晚期，NO的产生主要由iNOS介导。

NO的细胞保护作用主要通过蛋白质的翻译后修饰(S-亚硝基化作用)，激活环磷鸟苷酸(cGMP)第二信使系统和形成过氧亚硝酸盐实现。S-亚硝基化可抑制N-甲基-D-天门冬氨酸受体活性[18]及抑制细胞凋亡[19]达到神经保护作用。许多研究表明，cGMP信号通路激活蛋白激酶G(PKG)，抑制细胞死亡。Costa等[20]研究证实，在心肌细胞的缺血再灌注中，PKG的激活能促使线粒体三磷酸腺苷(ATP)敏感的K通道(mitoKATP)开放，通过调节线粒体内膜通透性转换孔的开启和关闭，减少细胞色素C从线粒体内释放，从而抑制细胞凋亡的发生。NO与超氧化物反应生成过氧亚硝酸盐具有神经保护作用。Liu等[21]证实过氧亚硝酸盐能够诱导血管舒张并抑制血小板聚集。Rassaf等[22]研究表明，过氧亚硝酸盐的增加对心脏有保护作用，进一步验证了NO的保护效应。

Belaidi等[23]研究表明，iNOS是HIF-1的靶基因，低氧情况下，HIF-1表达上调的同时，NO的表达也增加。因此推测脑缺血后NO的升高作为一种生物学机制，在脑缺血保护机制中起重要作用。

2 临床研究

临床上很难对缺血再灌注部位进行缺血预处理。近年来研究证实，一个器官的短暂缺血可诱导另一个器官的缺血耐受，这一现象被称为远隔器官缺血预处理(remote ischemic preconditioning，RIPC)。目前国内外有大量RIPC的研究，大量证据证明了其的安全性和有效性。Li等[24]在10例大脑中动脉狭窄及24名健康志愿者中进行肢体远端缺血预处理，包括200 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)上臂加压5 min后再灌注，重复5个周期，结果提示受试者血压和心率均在正常范围内波动，验证了LRIPC的安全性及可行性。Meng等[25]的前瞻性随机试验则证实了双侧上臂短暂缺血预处理对减少脑卒中复发的有效性，试验选取了68例有症状性动脉粥样硬化性颅内动脉狭窄的病人，其中38例接受300 d的RIPC，包括双侧上肢袖带加压至200 mmHg及再灌注，每天进行两次，每次5个周期，在第90天和第300天试验组复发性卒中发生率分别为5.0%和7.9%，而对照组在第90天和第300天的发生率分别为23.3%和26.7%，提示远隔器官缺血预处理具有神经保护作用。Liu等[26]应用RIPC大鼠模型对预处理后1 h及再灌注后3 d的血液进行流式细胞学分析，发现RIPC可以阻止短暂大脑中动脉闭塞后CD3+、CD8+T细胞及CD3+、CD161a(+)NKT细胞的减少，提高外周血中B细胞的百分比和CD43+、CD172a(+)非炎症性单核细胞的百分比，并诱导白介素-6(IL-6)的表达和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的增高。以上提示RIPC可以在严重脑缺血来临前通过动员外周免疫系统来提供保护作用，从而增强宿主的防御作用，体现了机体的调节作用。