环状RNA在非酒精性脂肪肝中作用机制的研究进展

2019-01-05余贞，孙静，王妍，孙辉

转化医学杂志 2019年6期

余贞，孙静，王妍，孙辉

近几十年，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的患病率在全世界范围内快速增长，尤其是在亚太地区，已接近西方水平，因此，NAFLD逐渐成为研究的热点。近年来，关于非编码RNA与NAFLD的研究越来越多，绝大多数研究集中于微小RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)对于NAFLD的发生发展的影响。随着对环状RNA(circular RNA，circRNA)研究的深入，人们发现circRNA参与了许多人类疾病，包括肿瘤，神经系统疾病，糖尿病，动脉粥样硬化，朊病毒病，而circRNA与NAFLD的研究报道较少，作者对circRNA与NAFLD关系研究进展作一综述。

1 NAFLD

NAFLD定义为无继发性原因，如使用致脂药物或饮酒过量(男性>30 g/d，女性>20 g/d)等，而影响肝细胞>5%的脂肪变性。目前，NAFLD在美国的患病率为10%～40%，在亚太地区的患病率为7%～40%，已成为导致慢性肝脏疾病的主要原因，有逐渐超过酒精性肝病和病毒性肝炎发病率的趋势[1]。NAFLD是由肝脏脂肪特异性堆积进而引起肝脏脂肪变性的一种临床综合征，与高血压、糖尿病、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、脂代谢异常和肥胖等因素密切相关。因此，NAFLD的治疗也是在纠正糖尿病、肥胖、代谢综合征等病因的基础上进行的，而目前所研究的各种药理学方法都不太有效，了解NAFLD的发病机制对其临床研究及治疗的进展变得尤为重要。已有研究表明，miRNA、lncRNA在NAFLD的发病机制、筛查、诊断和分期中都起着至关重要的作用。Nie等[2]通过微阵列发现在NAFLD小鼠肝脏组织中有10个miRNA差异性表达(5个上升，5个下降)，通过基因本体论数据库分析和京都基因和基因组百科全书数据库分析发现差异表达的miRNA主要参与“胃酸分泌”、“心脏肾上腺素能信号通路”、“癌症”、“MAPK信号通路”、“紧密连接”、“恰加斯氏病”、“细胞粘附分子”、“鞘脂质信号通路”、“神经营养蛋白信号通路”、“丙肝”，说明miRNA参与多种过程，包括信号转导、应激反应、增殖、分化和癌症。孙传政等[3]采用lncRNA-mRNA基因芯片检测发现，与正常样本相比，NAFLD肝样本内共有1 735个lncRNAs和1 485个mRNAs异常表达，其中535个lncRNAs和760个mRNAs上调，1 200个lncRNAs和725个mRNAs下调，这些差异表达的lncRNA可能参与了NAFLD的发生过程。

2 CircRNA

CircRNA是一类主要由一个以上外显子构成的环形RNA分子，大量存在于真核细胞，具有一定的组织、时序和疾病特异性。近年来，随着生物信息学技术的快速发展，circRNA这一古老且具有保守特征分子的神秘面纱逐渐被揭开[4]。Jeck等[5]在人类成纤维细胞中检测到了高达25 000多种circRNA。Salzman等[6]发现了数以百计的与人类基因表达相关联的circRNA。Memczak等[7]则从RNA测序数据中鉴定出1 950种人类circRNA、1 903种小鼠circRNA和724种线虫circRNA。Guo等[8]发现了人类细胞系相关的39种生物样本中的7 112种circRNA。目前发现的circRNA根据其在基因组中的来源及其构成序列的不同，可以分为3类：外显子来源的环形RNA分子(exonic circRNA)，内含子来源的环形RNA分子(intronis circRNA)和由外显子和内含子共同组成的环形RNA分子(exon-intron circRNA)。与线性环状RNA相比，circRNA具有更稳定的分子结构，其中一些外显子的3′端反向连接其他上游外显子的5′端形成封闭分子，由于缺乏游离末端，这些分子能够抵抗核糖核酸外切酶[9]。CircRNA分子功能包括miRNA海绵、调控转录基因、作为翻译模板等，在基因调控中发挥着重要作用。研究发现，circRNA参与了多种疾病包括多种肝脏疾病。在异丙肾上腺素诱导的心肌肥大小鼠中强制表达心脏相关circRNA可缓解心肌肥大；circRNA Cdrlas会影响胰岛素分泌和胰岛B细胞的更新；has-circ-001988在癌组织中减少，与肿瘤细胞分化的程度及预后相关[10]；另外，circRNA还被发现参与了非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝再生、肝细胞肝癌等肝脏疾病，而circRNA参与NAFLD却鲜有报导。

3 CircRNA参与NAFLD的发生过程

NAFLD的发病机制还尚不明确，目前受青睐的“二次打击理论”较好地阐述了其发病过程。代谢的失衡和非酯化脂肪酸流入肝脏增加，是导致NAFLD的主要原因。三酰甘油的积累诱发第二阶段的发生，包括氧化应激、前炎性因子的释放和内质网应激，进而引发肝脏的炎性反应，导致内皮一氧化氮功能紊乱，诱发IR，而IR和高胰岛素血症又是NAFLD的始动因素[10]。无可置疑，其发生过程中必然有信号转导通路的改变，而circRNA作为内源竞争RNA和miRNA海绵等参与其中。Li等[11]研究发现，NAFLD组织中CircScd1表达明显低于对照组，此外，过表达CircScd1可显著抑制脂滴的形成，通过Western Blot分析最后总结出了CircScd1的异常表达影响NAFLD肝细胞脂质增多的程度，并通过JAK2/STAT5通路促进脂肪肝的发生，结果显示CircScd1参与了NAFLD的发生过程。

3.1 CircRNA与IR IR是导致NAFLD发生及发展的根本原因。外周IR导致高胰岛素血症和脂质分解增多，产生和提供更多的游离脂肪酸(free fat acid，FFA)到肝细胞，以重新脂化和进行β氧化，促使FFA及甘油三酯在肝细胞的蓄积，并可能诱导脂质过氧化，另外FFA本身可以进一步阻碍胰岛素信号转导，因此加重IR。而我们已知，CDRlas(CiRS-7)在糖尿病的诊疗过程中具有重要作用。胰岛B细胞受损，胰岛素分泌绝对或相对不足(IR)，会使血糖升高，从而引发糖尿病[12]。Wang等[13]研究发现，miR-7能够负调节胰岛B细胞增殖，其在胰岛B细胞中的过表达会损伤胰岛B细胞的去分化功能，并导致胰岛素分泌的下调，从而引起糖尿病。另外，miR-7通过雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制胰岛B细胞增殖，而CDRlas(CiRS-7)能够抑制miR-7功能，从而刺激胰岛B细胞扩增。因此，CDRlas(CiRS-7)可能影响胰岛B细胞的更新，同时也是糖尿病的潜在作用靶点。

3.2 CircRNA与肝脏脂肪变性 Guo等[14]通过微阵列分析评估，将正常组与肝脂肪变性组进行比较得到肝脏脂肪变性与357个circRNA有关，包括154个上调和203个下调的circRNA。Guo等[15]进一步研究发现，高脂诱导下circRNA-021412的表达减少，从而对miR-1972的竞争性抑制作用减弱，重新激活的miR-1972诱导LPIN1表达减少，最后破坏脂肪生成和催化分离的平衡导致肝脏脂肪变性。LPIN1已被证实在肝细胞中分别作为磷脂酸磷酸酶和转录激活因子发挥双重作用。首先，它通过催化内质网中甘油三酯生成的倒数第二步来抑制脂肪生成，其次，LPIN1与转录因子(PPAR-α，PGC-1α)的直接作用，在脂质相关基因表达中放大了肝脏PGC-1α/PPAR信号。与此相关，miR-34a对PPAR的抑制作用表明其是肝细胞脂肪生成的重要诱导因子。Guo等[16]又发现circRNA-0046367作为miR-34a海绵和内源竞争RNA作用于PPAR，circRNA-0046366则被认为是miR-34a的5种miRNA的拮抗剂。当circRNA-0046367或circRNA-0046366缺失时，miR-34a激活，发生PPAR抑制，最后导致肝脏脂肪变性和脂质过氧化。

4 CircRNA参与NAFLD的进展

NAFLD进展较为缓慢，一般情况下，NAFLD无临床症状，多是在健康体检或检查其他疾病时发现肝功能异常或脂肪肝。但随着病情进展，会出现单纯性脂肪肝(肝脂肪堆积)、NASH、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等一系列疾病[17-19]。

4.1 CircRNA与NASH NASH是NAFLD的重要分期。Jin等[20]使用基因芯片检测NASH小鼠circRNA和mRNA表达谱的变化，发现了69个上调和63个下调的circRNA以及2 760个上调和2 465个下调的mRNA，并预测了4条经qRT-PCR验证的circRNA-miRNA-mRNA通路。因此，circRNA与NASH的发生和发展存在一定关联。周玉平等[21]采用高通量circRNA芯片技术比较正常组与肝纤维化小鼠组的circRNA表达谱变化，显示共有69个circRNA差异表达(表达差异两倍以上，P<0.05)，qRT-PCR实验证实其中4个差异表达有统计学意义，提示circRNA可能与肝纤维化进展有关。

4.2 CircRNA与肝再生对于大多数NAFLD患者而言，NAFLD除了会发展成肝硬化、肝细胞癌，另一个重要的威胁就是肝再生能力受损。临床及实验研究都发现脂肪变性肝脏在损伤、手术、移植后再生功能受损、再生时间延长，甚至可能诱发肝功能衰竭及机体死亡[22]。Li等[23]通过RNA测序技术和生物信息学分析获取了在大鼠70%肝切除术后肝再生初始阶段中差异表达的circRNA及其亲本基因，并构建了circRNA-miRNA网络，其中包括了159个差异表达的circRNA及116个相应的亲本基因。通过集中验证，确定了6个具有关键调控作用的circRNA。以上研究提示，circRNA在肝再生的机制中扮演着重要角色。

4.3 CircRNA与肝细胞癌目前，临床上缺乏除了甲胎蛋白以外的更加有效的肝细胞癌诊断和预后标志物。与线状RNA不同，circRNA通过特定的剪接方式形成共价闭合连续环路结构，高度保守且性质稳定，在人体某些组织的表达水平超过其线性异构体的10倍[6]。Shang等[24]检测了肝癌变组织中3个circRNA(hsa-circ-0000520、has-circ-0005075、has-circ-0066444)的表达水平，结果发现has-circ-0005075是一个潜在的肝癌标志物。Li等[25]在研究中首次发现大量肝细胞癌来源的exonic-circRNA，经RNA检测后，筛选出超过1 000种exonic circRNA,揭示了circRNA在肝细胞癌检测与诊断方面的应用前景。周英利等[26]在研究中发现，circRNA有可能通过与Lin28B相互结合从而抑制Lin28B蛋白的表达，进而抑制Lin28B作为癌基因的功能，影响肿瘤的发生发展。