心肌细胞程序性坏死——心脏疾病防治的新靶点

李靖南 张俊霞 张岩

110001沈阳，中国医科大学(李靖南)； 100871 北京大学膜生物学国家重点实验室，分子医学研究所(张俊霞、张岩)

心肌细胞是终末分化细胞，再生能力非常有限。很多损伤因素都会引起心肌细胞过度死亡，而死亡的心肌细胞无法得到有效的补充，会引起心脏功能单位的永久性丧失，进而导致包括心肌梗死、恶性心律失常、心力衰竭和心原性猝死等多种心脏疾病的发生[1]。因此，阐明心脏细胞死亡的机制、确定干预方法，对减少心肌细胞死亡和防治心脏疾病具有重要意义。

在过去的几十年里，由于细胞凋亡(apoptosis)被认为是唯一一种受调控的细胞死亡方式，大多数关于细胞死亡的工作都集中于细胞凋亡。而细胞坏死(necrosis)由于被认为是“不受管制的”或“偶然发生的”，因此虽然细胞坏死是多种心脏病变的主要病理特征之一[2]，其作用被完全忽略。然而，近年来这一观念逐渐受到了挑战，即细胞坏死很可能也是一种可调控的死亡方式，至少一部分细胞坏死是可以调控的，称为程序性坏死(programmed necrosis)[3-4]。对这些过程的遗传和生化分析表明，坏死取决于引发死亡的刺激，而且是由适当的机制组织和执行的，而不是简单的无序过程。最近的研究结果表明，程序性坏死在包括心脏在内的多种器官和组织的病生理过程是存在的，并发挥重要作用[2，5]，此外还有一些与程序性坏死的形态学定义相一致的细胞死亡类型，包括焦亡(pyroptosisi)、铁死亡(ferroptosis)等。本综述关注于心肌细胞程序性坏死的调控机制，及其病理意义方面取得的最新进展，尤其是在心脏疾病防治中的潜在价值。

1 心肌细胞程序性坏死的机制

1.1 线粒体与心肌细胞程序性坏死

线粒体是细胞重要的产能细胞器，也参与细胞的程序性坏死的调节。健康的线粒体内膜(inner mitochondrial membrane，IMM)不会被小分子甚至质子渗透，导致膜间隙和线粒体基质之间存在化学梯度和电梯度。这些梯度对于呼吸过程中将二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)转化为三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)是必需的[6]。因此，维持IMM的完整性是保持线粒体正常功能的关键。与细胞凋亡过程中发生的线粒体外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)失衡不同，细胞坏死通常会破坏IMM，从而导致线粒体渗透压孔道(mitochondria permeability transition pores，mPTPs)的开放。

腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)、电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)、亲环素D(cyclophilin D， CypD，一种肽基脯氨酰-顺反异构酶)和IMM中的磷酸盐载体(phosphate carrier，PiC)、以及在OMM中的外周苯并二氮受体(peripheral benzodiazepine recepter，PBR)和己糖激酶(hexokinase，HK)，被认为是mPTPs的组成成分。然而，mPTPs的确切成分尚未确定。ANT在mPTPs中的作用，是由受腺嘌呤核苷酸与ANT结合引起的Ca2+诱导mPTP开放的敏感性降低所证实的。相反，通过遗传学手段，却发现ANT对mPTP功能并非是必需的。因此，ANT可能并不是mPTPs的一个关键组分，而只是发挥调节作用。VDAC是OMM中最丰富的蛋白，它能与ANT被共同纯化出来，推测这两种蛋白可以在OMM和IMM之间的接触位点相互作用。然而，Ca2+和氧化应激诱导的mPTP开放并不受三种小鼠VDAC基因(VDAC1、VDAC2和VDAC3)全部缺失的影响，说明VDAC对于mPTP的功能也不是必需的。由Ppif基因编码的CypD是位于线粒体基质中的肽基脯氨酰—顺反异构酶。CypD的缺失在体外和体内都能保护细胞坏死，而CypD过度表达的作用则正好相反[2，5]，表明CypD是mPTP和坏死的关键调节因子。然而在CypD缺失的情况mPTP依然能够开放，说明其也不是mPTP必需的结构组分。

启动mPTPs的主要原因是线粒体基质Ca2+浓度升高和氧化应激。最近，利用双敲除实验发现，促凋亡蛋白Bax和Bak参与调节mPTP的功能和细胞过程[7]。研究表明，PI3K/Akt/FoxO3a/Bnip3L通路在过氧化氢(hydrogen peroxide， H2O2)引起的H9C2心肌细胞坏死和线粒体功能障碍中起重要作用。随后，激活的Bnip3被证明能够作用于线粒体，引起线粒体碎裂、线粒体自噬和坏死。

mPTP的开放有几个直接的后果，包括呼吸驱动的ATP合成停止、由于线粒体膜电位(ΔΨm)的崩溃，使FoF1-ATP合成酶活性反转、溶质和离子在IMM上的再分布，由于大量的水进入富溶质基质而造成的渗透压梯度破坏。水的进入导致线粒体基质膨胀和IMM的扩张。而由于与OMM不同，IMM具有冗余性，不易破裂，因此线粒体基质扩张会导致OMM破裂，使凋亡刺激因子(即细胞色素C)释放到胞浆中。凋亡刺激因子的释放会触发凋亡小体组装和caspase的激活[5]。最近还有研究发现脂质过氧化也是mPTPs开放和氧化应激导致细胞坏死的重要因素。此外，mPTPs的开放导致ATP水平降低。虽然严重的ATP耗竭和细胞膜完整性的丧失是坏死时细胞死亡的主要原因，但下游凋亡信号的激活也对此有贡献[6]。

最近的研究表明，“线粒体蛋白激酶”，如蛋白激酶B，蛋白激酶C，细胞外调节激酶，糖原合成酶激酶3β和己糖激酶Ⅰ、Ⅱ等，除了分布于胞浆以外，也在线粒体内有分布，能够接收细胞内分子的信号，从而决定细胞的死亡或存活。这些激酶通过相互之间，以及与mPTP组分之间形成复合物，进而调节mPTP的开放。

1.2 死亡受体依赖的心肌细胞程序性坏死

研究表明，在某些类型的细胞中，在细胞凋亡受抑制的情况下(即抑制caspase)，激活死亡受体刺激依然能诱导细胞死亡，此种细胞死亡具有细胞坏死的形态学特征，提示程序性坏死的存在[8]。2005年，此种细胞坏死被Degterev等[6]命名为“程序性坏死”。最近的数据还显示，激活通常引起凋亡的死亡受体，如肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor recepter，TNFR，包括TNFR1和TNFR2)、TNF相关的凋亡诱导配体和Fas配体受体，也可以引发细胞程序性坏死。在这些受体中，TNFR1是被研究最为透彻的。TNF与TNFR1的结合促进了复合物I的形成，其中还包括通过死亡域相关的TNF受体超家族1A(TRADD)修饰因子，受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1，RIP1)、TNF受体相关因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)和凋亡抑制蛋白cIAP1和cIAP2，它们能够通过活化NF-κB，进而引起多种促细胞生存基因的表达[9]。复合物I通过一系列的变化转化为复合物II，其中包括复合体I的内吞、TNFR1的解离、CYLD和A20 引起的RIP1去泛素化，以及Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated death domain protein， FADD)和caspase-8的聚集。如果caspase-8不被抑制，它可以切割RIP1，从而刺激多个存活基因的表达；这种刺激在活性氧(reactive oxygen specie， ROS)存在的情况下会增强[10]。在TNF/z-VADfmk诱导的程序性坏死信号通路中，RIP1/RIP3复合物似乎并不是必需的，一些与RIP1-RIP3平行的其他可能通路也可能同样重要。

确定程序性坏死启动以后的下游事件对明确细胞坏死的过程、并相应的研发干预策略非常重要。虽然对RIP1和RIP3的下游事件尚不完全清楚，但已有的研究发现混合谱系激酶样蛋白(Mixed lineage kinase domain-like protein， MLKL)的磷酸化[11]，磷酸甘酸变位酶5(phosphoglycerate mutase 5， PGAM5，线粒体磷酸酶)[12]和某些分解酶(谷氨酸脱氢酶1，谷氨酸氨连接酶和糖原磷酸化酶)等是其重要的下游分子。最后一个信号通过ROS的产生引起死亡[10]。其它涉及坏死的下游事件包括钙蛋白酶、磷脂酶、脂氧合酶和鞘磷脂酶的激活和溶酶体LX的通透。然而也有研究显示，抑制PGAM5及其下游Drp1对TNF诱导的小鼠成纤维细胞程序性坏死无明显保护作用，提示RIP1/RIP3/MLKL坏死复合物的下游效应通路可能存在物种和细胞特异性。

3 其他形式的心肌细胞程序性死亡或类似坏死的细胞死亡

除了上面提到的程序性坏死形式以外，近年来其他几种具有细胞坏死特征的心肌细胞死亡方式，包括RIP3/Ca2+-钙及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ， CaMKⅡ)介导的心肌细胞坏死[13]、焦亡[14]和铁死亡[15]等，也被证明在包括心血管疾病在内的多种疾病过程中发挥作用。

4 心肌细胞程序性坏死与心脏疾病

细胞死亡，尤其是心肌细胞死亡，是多种心脏疾病的重要机制[16]。各种心脏疾病中心肌细胞死亡的程度、时程和动力学存在着明显的差异。例如，心肌梗死的特点是在缺血后24小时内出现大量的心肌细胞死亡。相反，心力衰竭会导致持续数月至数年的心肌细胞死亡，其水平虽然较低，但仍比健康人高100倍[17]。由于最近大量的研究表明，不仅细胞凋亡，细胞坏死也受到严格调控，使人们对可控性细胞死亡在心脏疾病中的作用重新产生兴趣。

4.1 心肌缺血损伤

心肌梗死是缺血性心脏病/冠状动脉疾病的常见表现，是世界范围内死亡的主要原因。防治心脏缺血损伤的最佳方法是恢复心肌组织的血流，即再灌注。然而，心脏再灌注治疗可引起心肌细胞的另一种损伤，即缺血/再灌注损伤。在临床治疗中，坏死一直被认为是心肌梗死和缺血/再灌过程中的主要心肌细胞死亡类型。而且程序性坏死已被证实在两种心脏损伤的发展中起着关键的作用。

心肌缺血导致的心肌梗死与细胞坏死之间最紧密的联系是mPTP。缺血导致缺氧、无氧代谢和细胞内酸中毒。作为对酸中毒的反应，Na+/H+交换器将H+泵出细胞，从而使细胞内[Na+]大量增加。进而由Na+/Ca2+交换泵处理过量的Na+，细胞内[Ca2+]水平随之升高。胞内[Ca2+]的进一步升高是由于Ca2+诱导内质网/肌浆网的钙释放和再灌注[18]。这些活动中的每一项都有助于启动mPTP。CypD是mPTPs的重要正调节因子。缺乏CypD的细胞对氧化应激/Ca2+诱导的细胞死亡具有抗性，但对凋亡刺激敏感。CypD基因缺失和药理抑制均能减少对缺血/再灌小鼠梗死面积的影响[2，5]。

虽然RIP1/RIP3信号的细节仍不清楚，但RIP1的低分子量抑制剂Necrostatin-1在体内缩小了因缺血/再灌而梗死的范围。有趣的是，Necrostatin-1的心脏保护作用依赖于CypD的存在，提示RIP1与线粒体坏死有关。虽然这种潜在联系的分子机制仍不清楚，RIP3在坏死期间激活代谢途径导致ROS的产生是一个可能的解释。由于RIP3-CaMKⅡ-mPTP心肌坏死通路的抑制，选择性抑制剂KN-93对CaMKⅡ的抑制对缺血/再灌诱导的心肌梗死和坏死有明显的抑制作用[13]。综上所述，这些研究再次证明，除了凋亡，坏死也参与了心肌梗死的发病机制。

最近，Bax和Bak这两种细胞凋亡的生物标志物也被证明对坏死有调节作用。Bax和Bak的缺失可明显减轻缺血/再灌所致的心脏坏死。这些作用很可能是通过与Bax和Bak对细胞凋亡的调节不同的途径产生影响，如介导凋亡的关键位点突变的Bax突变体仍然能够介导细胞坏死。此外，缺氧/复氧治疗对原代大鼠心肌细胞缺血/再灌损伤的影响的研究显示，热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP 70)通过抑制心肌缺血/再灌注过程中的自噬作用，下调心肌细胞的坏死，揭示了HSP 70新的蛋白机制，并且进一步证实了可控性细胞坏死与缺血/再灌损伤的关系。

目前，microRNAs(miR)也被证明能够在缺血/再灌引起的程序性坏死中发挥调节作用。已有报道显示miR-223 KO小鼠中程序性坏死相关的蛋白表达上升，而其转基因小鼠则相反，而且miR-223的变化与心脏对缺血/再灌引起的程序性坏死的抵抗力有关。此外，两种能够引起细胞程序性坏死的死亡受体(TNFR1和死亡受体6)[19]是miR-223的靶点。

4.2 心力衰竭

心力衰竭是一种由于心脏泵血无法满足身体的需要而引起的临床综合征。心肌梗死是引起心力衰竭的最常见的原因之一。进行性的心肌细胞损失和心脏功能障碍是心力衰竭的重要特征。虽然对坏死细胞的明确鉴定仍有疑问，但与对照组相比，心力衰竭心脏心肌细胞坏死率明显升高，且似乎超过了凋亡比率，这在早期的研究中被证明是导致细胞在终末期心力衰竭死亡的关键因素之一。

在心力衰竭与坏死的关系中，Ca2+处理和mPTP开放可能是关键因素。心肌细胞中L型钙通道β2a亚基的过表达，能够导致细胞内钙超载、心肌细胞坏死和心力衰竭。重要的是，CypD的缺失而不是Bcl-2的过表达能够挽救这种表型。同样，阿霉素所致的心肌病也能通过剔除肽类酰脯氨酸异构酶F而得到改善。在压力/体积超负荷引起的心力衰竭中，TNFR1相关的程序性坏死通过促进促炎基因的表达，包括编码肿瘤坏死因子等来发挥作用。心力衰竭组RIP1、磷酸化和总RIP3、以及MLKL的水平均高于对照组；另一方面，RIP3和磷酸化MLKL的亚细胞定位与死亡信号的激活是一致的。

尽管上述证据表明坏死可能参与了人类心力衰竭和扩张型心肌病的发展。与心肌梗死相比，程序性坏死在心力衰竭中的作用仍然缺乏决定性证据，心力衰竭心脏中心肌细胞坏死的程度及对此综合征发病机制的普遍适用性，还需要在今后的工作中加以论述。

5 结论

人们对细胞坏死的可控性的认识的加深，对许多不同的科学和医学领域都产生了影响。首先，这种认识提出了关于细胞坏死的生理作用，坏死和其他死亡过程之间的分子联系，以及各种细胞死亡形式之间的进化关系的问题。此外，来自体内和体外研究的越来越多的证据表明，心脏细胞死亡在心脏疾病的发病机制中起着重要的作用。因此，尽管还有一些问题仍未被解决，但是可控性心肌细胞坏死为心脏疾病的防治开辟了一个崭新的方向。未来的研究旨在发现程序性死亡信号的新成分和调控机制。此外，高特异性、低毒、更适合临床应用的新抑制剂开发的转化医学研究也是必要的。

利益冲突：无