牙周组织工程的研究进展

吕雪雯，潘春玲

（中国医科大学附属口腔医院牙周科，辽宁省口腔医学研究所牙周病研究室，中国医科大学口腔医学院中心实验室，辽宁省口腔疾病重点实验室，辽宁省口腔疾病转化医学研究中心，沈阳 110002）

牙周病是世界范围内患病率较高的疾病，在我国，牙周病的患病率居于龋病之上，是成人牙齿丧失的首位原因。健康的牙周组织是口腔各种疾病治疗的基础，越来越多的研究表明，牙周病与全身健康和疾病有着密切的双向关系。牙周治疗的目标是多种牙周组织的再生，包括牙槽骨、牙骨质和牙周膜。非手术性的牙周治疗通过清除病原体和坏死组织，可以控制疾病的发展，但只有少量的牙周组织可以在治疗部位再生［1］。牙周组织工程是应用细胞生物学和工程学原理，在活体上取得相关的目的种子细胞，体外扩增后，接种到生物相容性好的天然或人工合成的细胞支架上，与此同时，提供生长因子微环境，经过一定时间的体内或体外继续培养，通过细胞自我更新和细胞间的相互作用，形成具有一定外形、结构和功能的组织或器官，以行使功能的一门技术［2］。

因此，依托牙周组织工程使牙周炎患者获得牙周组织再生，对口腔健康乃至全身健康有着重要的意义。本文就牙周组织工程的种子细胞、生长因子及支架材料的研究进展进行分析、总结，为深入牙周组织工程研究提供一定参考，从而促进牙周炎患者牙周组织损伤的修复与再生。

1 种子细胞

牙周组织工程中应用的种子细胞主要包括牙源性干细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪来源的干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）等。理想的种子细胞应具备以下特点：收集较为容易，数量较多且增殖分化能力强，取材过程对机体创伤小，植入体内的方式安全有效，移植后无免疫排斥反应且可按照预期分化等。

1.1 牙源性干细胞

目前，已从牙体、牙周组织中成功分离并培养出的相应的牙源性干细胞有牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、牙髓干细胞、脱落乳牙干细胞、根尖乳头干细胞、牙龈间充质干细胞、牙囊细胞等［3］。

其中，PDLSCs是牙周治疗后形成牙龈与牙根面新附着的主要细胞来源，对牙周组织重建有着至关重要的作用，PDLSCs已成为牙周组织工程的首选种子细胞［4］。PDLSCs不仅具有很强的自我更新能力和多向分化潜能，能被诱导生成成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞及神经元细胞等，还可通过旁分泌作用发挥免疫调节作用［3］。2004年，SEO等［5］通过酶消化法从健康成年人的牙周组织中分离出具有易体外扩增和克隆能力的细胞，首次提出了人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的概念。近期，PIZZICANNELLA等［6］的研究评价了hPDLSCs的行为。异种移植颗粒（G）是一种来源于牛松质骨的完全脱蛋白的羟基磷灰石陶瓷支架，将含和不含G的hPDLSCs培养24 h～1周，结果提示，G不仅是一种具有足够生物相容性的三维生物材料，而且也是miR-210和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的有效诱导剂，而miR-210参与VEGF的分泌，可以在骨再生的早期阶段提供一个新的调节系统。诱导hPDLSCs 产生这种生长因子，可在骨整合的第一阶段用于诱导生物材料周围血管的生长。因此，hPDLSCs/G结构可以作为一种有希望的策略来预制带血管的骨段移植到缺损部位。NAGATA等［7］的研究指出，由于在各种疾病模型中种子细胞移植后细胞存活率较低，其旁分泌功能作为一种再生机制受到越来越多的关注。研究人员利用大鼠牙周组织缺损模型，研究PDLSCs移植条件培养液在支持牙周组织中的再生潜能。采用超滤法从PDLSCs和成纤维细胞中提取无细胞的条件培养液，移植到手术造成的牙周缺损中。PDLSCs-条件培养液移植以浓度依赖性方式促进牙周组织再生，而成纤维细胞-条件培养液没有显示任何再生功能。蛋白质组学分析表明，PDLSCs-条件培养液中含有细胞外基质蛋白、酶、血管生成因子、生长因子和细胞因子。此外还发现PDLSCs-条件培养液通过抑制肿瘤坏死因子-α产生的炎症反应而促进牙周再生，因而PDLSCs-条件培养液移植可成为牙周再生治疗的新途径。

1.2 BMSCs

BMSCs具有丰富的来源，取材较为简便，对机体的损伤小，且具有较强的增殖能力和分化能力。MU等［8］研究了猪的自体无支架间充质干细胞片移植到口腔牙槽骨表面以刺激局部骨生长的可行性和有效性，结果表明了猪的下颌BMSCs可制备成细胞片，自体BMSCs移植到拔牙处骨膜下颊侧牙槽骨表面，可增加局部骨密度。REZAEI等［9］研究了3种关键再生因子——富血小板血浆、犬BMSCs和纤维蛋白胶，对牙周组织再生的影响。实验共选取5只犬，每只犬在5颗牙齿的颊面上建立Ⅱ级分叉缺陷，发现并阐明了不同类型的新骨和牙骨质、新牙骨质和牙周膜的最大厚度、骨的活力以及炎症或异物反应的存在，证明了BMSCs在牙周组织工程中具有良好的应用前景。

1.3 ADSCs

脂肪组织来源丰富，其内由大量脂肪细胞组成，容易分离。可以通过抽脂术提取ADSCs，该术式对人体损伤小、风险低、痛苦少［10］。并且ADSCs体外培养易存活，增殖活性强，传代多次后仍能维持向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等分化的多向分化潜能。鉴于以上优点，ADSCs成为牙周组织工程发挥重要作用的种子细胞之一。MOHAMMED等［11］提出，在许多情况下，牙周基础治疗的价值有限，因此采用辅助治疗来提高其疗效。ADSCs/基质细胞在牙周组织再生研究中取得很好的结果，外显子是介导干细胞/基质细胞作用的细胞外囊泡。用结扎法诱导50只大鼠牙周炎14 d，并将其分为对照组、牙周基础治疗组、ADSCs组和外显子组。结果显示，外显子和ADSCs都能够形成新组织，外显子组在4周内获得了与正常健康组织相当的牙周组织，说明了ADSCs/基质细胞及其外显子是牙周基础治疗的一种有希望的辅助治疗。

2 生长因子

生长因子是一种具有牙周组织修复功能的多肽类蛋白质，具体表现在促进细胞的生长、增殖、分化、趋化、新陈代谢等。牙周组织工程中重要的生长因子主要有血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、骨形态发生蛋白、釉基质蛋白衍生物等。

2.1 PDGF

血小板衍生生长因子是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质。THOMA等［12］的观察了2种生物介质——重组人骨形态发生蛋白-2和重组人血小板源性生长因子在诱导犬骨缺损再生中的作用，并根据组织形态计量学指标与对照组进行比较。研究表明，与对照组相比，2种生物介质在一定时间内均能增加骨再生的数量，但在超过一定时间后，由于硬组织重塑过程的增强而不能增加骨再生量。KAVYAMALA等［13］比较和评价了重组人血小板源性生长因子和磷酸三钙共同作用与单纯磷酸三钙骨移植技术在治疗骨缺损患者时的再生潜能。结果显示，2组中所有参数都有明确改善，但共同作用组显示出更加明显的改善效果。因而表明，PDGF在治疗人牙周骨内缺损中具有重要作用。

2.2 bFGF

bFGF是一种属于肝素结合家族的多肽生长因子，具有促进细胞黏附、增殖、分化，促进创伤愈合，参与组织损伤的再生及修复等多种生物学作用，与牙周组织再生有密切关联。COLENCI等［14］在体外评估了bFGF在犬BMSCs增殖和表达Ⅰ型胶原和纤维蛋白中的作用，并与犬牙周成纤维细胞的表达进行比较。结果表明，bFGF刺激后，BMSCs增殖增加，纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原表达也有所增加。OGAWA等［15］研究了负载成纤维细胞生长因子-2的纳米β-磷酸三钙/Ⅰ型胶原支架对生物活性的影响，特别是对牙周组织创面愈合的影响。结果显示，含有成纤维细胞生长因子-2的纳米β-磷酸三钙支架更有利于牙周组织再生。

2.3 TGF-β

TGF-β是一种具有多种调节功能的生长因子，能够促进细胞黏附、生长，诱导DNA和纤维蛋白的合成，调控成骨分化，在牙周组织工程领域有重要应用。谭荣邦等［16］研究了TGF-β1与IGF-1在体外诱导BMSCs定向分化为软骨细胞中的作用，结果表明，单独使用TGF-β1或联合使用TGF-β1和IGF-1可以诱导BMSCs定向分化为软骨细胞。但单独使用IGF-1不能诱导BMSCs定向分化为软骨细胞。龙晏等［17］研究了TGF-β1对PDLSCs增殖和迁移能力的影响及作用机制，结果表明，TGF-β1可以激活Notchl信号通路，促进人PDLSCs的增殖和迁移。

2.4 IGF

IGF是胰岛素家族的一类多肽生长因子，可促进细胞的迁移、增殖、分化，诱导胶原和基质合成，参与牙槽骨形成，是牙周组织改建的重要因子。徐皑等［18］的研究表明，IGF和TGF-β单独或联合作用均能促进人牙髓干细胞的增殖，且IGF可促进牙周膜细胞的成骨分化，在牙周组织改建中发挥重要作用。屈俊秀等［19］的研究探讨了IGF-1对hPDLSCs增殖和分化的影响，研究表明，IGF-1促进人牙周膜成纤维细胞的增殖和胶原合成，进一步促进牙周膜成纤维细胞的分化。

3 支架材料

理想的支架材料应具有以下特点：材料易获取；具有良好的生物相容性和生物安全性，不引起机体免疫排斥反应；具有多孔性，使氧气和营养物质充分流通，能够为细胞分化增殖提供良好环境；具有生物可降解性等［20］。常用的支架材料根据成分可以分为3类，即天然衍生材料、人工合成材料和复合支架材料。

3.1 天然衍生材料

天然衍生材料是动、植物体内天然存在的大分子材料，因此具有良好的生物相容性和亲水性，细胞毒性和抗原性较弱，且具有较好的生物可降解性，但其机械强度低，力学性能较差［21］。牙周组织工程中常用的天然衍生材料主要有胶原、壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、天然骨组织等。

3.1.1 胶原：胶原作为支架材料，具有生物相容性好、毒性小、能够促进组织愈合等优点。近期，KAWAMOTO等［22］制备了一种新型的含有碳基二维层状材料的三维胶原支架，称为氧化石墨烯（graphene oxide，GO）支架。该团队对GO支架进行了细胞毒性试验和组织反应性试验，并在术后4周将GO支架植入犬Ⅱ类分叉缺损处，观察牙周愈合情况。结果表明，GO支架具较低的细胞毒性，增强了大鼠的细胞生长行为和骨形成能力。此外，GO支架植入后牙周附着形成明显增加，具有良好的骨和牙周组织形成能力。因此，GO支架是一种有希望的牙周组织工程的支架材料。

3.1.2 壳聚糖：壳聚糖是近年来研究较多的天然衍生支架材料，是几丁质经过脱乙酰作用后得到的自然界中唯一的阳离子多聚糖。几丁质在自然界广泛存在，原料获取简单，并有利于细胞黏附和携载生长因子，且具有良好的生物可降解性，可降解为葡萄糖胺和壳寡糖，随机体代谢排出［23］。VARONI等［24］的研究合成了一种基于壳聚糖的三层多孔支架，以实现由多组织同时愈合驱动的牙周再生。采用裸鼠牙周异位模型，将人牙龈成纤维细胞、成骨细胞和牙周膜成纤维细胞作为支架，在中等分子量壳聚糖区发现致密的矿化基质，牙本质界面有弱矿化沉积。结果表明，这种可吸收的三层支架是一种有希望的牙周再生支架材料。

3.2 人工合成材料

人工合成材料除了生物相容性好、可降解外，还具有可塑性好、加工灵活以及可进行化学修饰的特点。主要分为人工合成有机高分子聚合物和人工合成无机材料两大类，常用的人工合成有机高分子聚合物有聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯等，人工合成无机材料主要包括生物陶瓷类材料（如羟基磷灰石及纳米羟基磷灰石、磷酸三钙）、钛及钛合金、磷酸钙水泥等。

羟基磷灰石及纳米羟基磷灰石：羟基磷灰石的生物相容性和化学稳定好，能与体内天然骨组织形成具有一定生物力学强度的骨键合［25］，因此在牙周组织工程中作为支架材料被广泛应用。FIGLIUZZI等［26］的临床研究发现，在牙周炎患者的骨缺损处充填羟基磷灰石，术后有明显的牙周组织修复。但因其降解速率慢、脆性大、塑形性较差等不足，纳米羟基磷灰石应运而生。体内天然骨中的羟基磷灰石是以纳米级针状单晶体形式存在，纳米羟基磷灰石在纳米结构上与人体骨相似。纳米羟基磷灰石的纳米结构使其具有更大的表面积和较高的表面自由能，此特征有利于种子细胞黏附、增殖和迁移。TANSRIRATANAWONG等［27］的最新研究比较了具有羟基磷灰石样表面的磷酸氢钙（calcium hydrogen phosphate with a hydroxyapatite-like surface，CHP-HA）与传统的纳米羟基磷灰石的细胞附着、增殖和成骨分化情况。用CHP-HA或纳米羟基磷灰石培养PDLSCs，进行细胞黏附、增殖和成骨分化试验。结果表明，用这种新的CHP-HA培养的PDLSCs表现出更强的细胞反应，研究认为CHP-HA可能是一种很有前途的替代生物材料。

3.3 复合支架材料

复合支架材料是将2种或2种以上的支架材料运用特殊制备方法按比例混合而成，以充分发挥不同支架材料的优势，弥补其缺陷，从而更好地完成引导牙周组织再生的作用。陈立红等［28］采用冷冻干燥法制备不同比例的壳聚糖/聚乳酸复合支架，结果发现此复合支架既有足够的孔隙率以保证细胞的黏附和营养物质流通，又改善了孔隙率高时力学强度不足的缺陷。D’ANT等［29］成功制备了聚己内酯/羟基磷灰石复合支架，该支架的机械性能有所加强，且促进了细胞增殖和骨组织再生。但各类材料的最佳搭配方式、混合比例、制备技术等方面仍有许多问题亟待解决。

综上所述，牙周组织工程在牙周治疗中拥有广阔的前景，是牙周组织得以重建的关键技术。国内外研究人员对牙周组织工程中种子细胞、生长因子、支架材料三大要素的探索从未止步，各个要素之间联合作用的研究也愈来愈多，今后牙周组织工程仍有很多问题亟待研究。期待可以寻求到种子细胞、生长因子、支架材料最佳的组合及结合方式，并成功运用于动物实验模型，实现牙周组织外形、结构和功能的再生，为临床治疗牙周病提供理论基础和科学依据。