国外医学研究新进展（五）

杨柳

1 BRAF失活突变诱导肺癌发生

近乎一半的人类肺腺癌致癌的发病机制尚未明确，这常常会使选择性靶向药物的开发变得复杂化。然而这些肿瘤中可检测到许多没有明显致癌功能的突变，包括BRAF的失活性突变。在肺癌中BRAF（V600E）失活突变的频率远超其他癌症。我们通过研究发现，小鼠机体中内源性BRAF（D631A）激酶失活亚型的表达[相当于人类（D594A）突变]会在体内诱发肺腺癌的发生。这就表明，BRAF失活性突变或会诱发肺腺癌事件的发生。利用公共数据库进行研究，我们在一系列KRAS驱动的人类肺部肿瘤中鉴别出了失活的BRAF突变。随后我们利用小鼠模型进行研究，对相关研究结果进行了再现，结果表明，致癌Kras（G12V）和失活BRAF（D631A）的共表达或许会增加肺腺癌的发生率。我们还发现了野生型BRAF在维持Kras（G12V）/BRAF（D631A）驱动的肿瘤中的关键作用。野生型BRAF等位基因的缺失使致癌毒性的MAPK信号通路进一步增强，从而阻止肺腺癌的发展；Mek可抑制这一现象并恢复肿瘤的生长。然而，野生型BRAF的丧失也会引起棒状细胞的转分化，这导致致死性脑内神经根病变的快速发展。这些观察结果表明，MAPK通路的信号强度不仅是肿瘤发展中的关键因素，也是决定癌症起始细胞的性质以及最终表型的关键因素。[Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015 [J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.doi:10.1038/nature23297.]

2 转移癌的整合临床基因组学

转移癌是导致患者死亡的主要原因。虽然我们已经获得原发性肿瘤的癌症基因组测序图谱，但对转移癌的综合分子分析仍不清楚。我们纳入500例不同家族的成年患者，对其转移性实体瘤进行全外显子和转录组测序。转移性癌中最常见的基因突变包括TP53、CDKN2A、PTEN、PIK3CA和RB1。在12.2%的病例中存在推测的遗传变异，其中75%与DNA修复缺陷有关。RNA测序补充了DNA测序结果并明确基因融合、通路激活和免疫的变化。我们的研究结果表明，综合测序分析为复杂的基因图谱和转移性癌的微环境提供了多维的观察结果。[Robinson DR,Wu YM,Lonigro RJ,et al.Integrative clinical genomics of metastatic cancer [J].Nature,2017,548 (7667):297-303.doi:10.1038/nature23306.]

3 MACC1和基因错配修复对Ⅱ期结肠癌患者复发风险的预测价值

目的：基因MACC1可根据错配修复（pMMR）情况将Ⅱ期结肠癌患者进行预后分组。

方法：本研究纳入596例患者，其中Charité 1队列检测冻存结肠癌肿瘤标本中MACC1 mRNA表达水平和MMR，Charité 2队列对FFPE样本进行MACC1 qRT-PCR分析。BIOGRID 1队列研究发现MACC1 mRNA表达水平与FFPE切片免疫组化中MACC1的蛋白水平相关。根据MACC1 mRNA和蛋白水平对化疗前pMMR患者进行风险分组并用无复发生存期（RFS）评估其准确性。BIOGRID 2队列证实BIOGRID 1的风险分组的正确性。综合BIOGRID数据后我们明确了最佳效应量的估计值。

结果：BIOGRID 1队列中qRT-PCR和免疫组化检测结果表明低pMMR/MACC1患者（5年RFS，92%/67%）比高pMMR/MACC1患者复发概率低（5年RFS，100%/68%）。BIOGRID2对列研究发现低pMMR/MACC1患者的RFS比高pMMR/MACC1患者长（5年RFS分别为100%和90%）。在综合数据集中，低pMMR/MACC1患者中6.5%无复发，导致其5年RFS（95%CI：12.6%～21.3%）比高pMMR/MACC1患者高出17%（P=0.037）。低pMMR/MACC1和MMR缺陷（dMMR）患者的预后相似（5年RFS分别为100%和96%）。

结论：MACC1表达水平的差异可预测pMMR的结肠癌患者的预后。低pMMR/MACC1的Ⅱ期结肠癌患者和dMMR患者都有良好的预后，这将影响临床医生对辅助治疗的选择。[Rohr UP,Herrmann P,Ilm K,et al.Prognostic value of MACC1 and proficient mismatch repair status for recurrence risk prediction in stageⅡcolon cancer patients:the BIOGRID studies[J].Ann Oncol,2017,28(8):1869-1875.doi:10.1093/annonc/mdx207.]

4 人类癌症转录组病理图谱

癌症是人类死亡的主要原因之一，因此了解个体肿瘤发生、发展的潜在分子机制是十分必要的。我们分析了17种不同癌症中蛋白质编码基因转录组与其临床预后的关系。结果发现细胞增殖基因上调/分化基因下调与患者生存期缩短有关。全基因组代谢模型分析发现癌症患者具有广泛的代谢异质性，因此癌症患者需要更精确和个体化的治疗。所有数据都可在数据库（www.proteinatlas.org/pathology）中下载，以便全面探索蛋白质对临床预后的影响。[Uhlen M,Zhang C,Lee S,et al.A pathology atlas of the human cancer transcriptome[J].Science,2017,357(6352).doi:10.1126/science.aan2507.]

5 异常生长修复可维持组织动态平衡

健康组织中的细胞以惊人的频率获得突变。许多突变与细胞的异常行为有关，例如细胞分化缺陷和过度增殖，但未产生宏观可检测的表型。尽管组织中存在突变细胞，目前研究者尚不清楚其如何保持表型正常。我们使用活体成像技术追踪小鼠上皮细胞的变化--其上皮内存在大量活化的Wnt/β-catenin干细胞。我们发现所有被破坏的皮肤组织结构都会恢复，无论其面积大小。野生型细胞是消除组织中突变细胞所必需的，其可同时利用内源和异位细胞的行为来消除异常结构。组织结构恢复后，剩余的结构要么完全消除要么转化为功能性皮肤附属物。此外，野生型细胞还可校正致癌基因Hras导致的组织异常，甚至是与突变无关的组织变形。这些耐受现象反映了皮肤的保守原则。这项研究揭示了当面临突变或非突变性损害时成人皮肤上皮意想不到的可塑性，并阐明了维持组织稳态时细胞的动态行为。[Brown S,Pineda CM,Xin T,et al.Correction of aberrant growth preserves tissue homeostasis [J].Nature,2017,548(7667):334-337.doi:10.1038/nature23304.]

6 早期胰腺癌肿瘤特异性DNA与蛋白质生物标志物的联合检测方法

癌症的早期诊断是降低其病死率的关键环节之一。我们致力于研发可应用于胰腺导管腺癌早期诊断的非侵入性血液检测技术。本文的研究目的在于比较血液KRAS基因突变联合蛋白质生物标志物的检出率是否优于任意单个标志物的检出率。实验包括221例可切除胰腺导管腺癌患者和182例健康对照者。我们在66例患者（30%）的血浆中检测到KRAS突变，并且每例患者血浆中发现的突变与随后原发肿瘤样本中发现的突变相同（100%一致性）。KRAS与四种蛋白生物标志物的联合检测使其灵敏度提高到64%。对照组中只有1例任何DNA或蛋白质生物标志物都是阳性的人（99.5%的特异性）。这种联合检测的方法可检测出多种早期癌症。[Cohen JD,Javed AA,Thoburn C,et al.Combined circulating tumor DNA and protein biomarker-based liquid biopsy for the earlier detection of pancreatic cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2017,114(38):10202-10207.doi:10.1073/pnas.1704961114.]

7 皮肤癌的红色警报——脂质

红色的头发在多种文化中都是魅力的象征，同时也越来越受到科学家的关注。对小鼠模型和人类细胞的研究发现皮肤癌发生的风险与某些蛋白质相关，而这些蛋白质与红发有关。

皮肤黑色素细胞和头发毛囊产生的黑色素可引起致命的黑色素癌。紫外线可导致DNA损伤并产生有害的突变，而黑色素可保护皮肤免受阳光的紫外线辐射。MC1R蛋白调节黑色素细胞分泌黑色素。黑色素细胞受MC1R蛋白刺激时产生真黑色素，但在MC1R信号低或缺如的情况下，主要产生一种红色或橙色的海马素。几乎所有红发个体都存在MC1R表达减少或缺乏的现象，因此大多数红发个体的皮肤白皙且不易晒黑。

MC1R基因能性突变可导致小鼠出现黄色皮肤，因此MC1R基因最先在小鼠中发现。许多其他物种也有与MC1R基因相关的色素变化，如红色或黄色毛发的狗。古欧洲血统的人类通常携带MC1R基因突变，他们红发颜色的深浅也与突变有关：一些突变总是导致红发，而另一些则不。MC1R突变是出现红发的必要不充分条件，这表明大多数突变是无功能突变，红发的出现还取决于其他遗传基因或细胞因子。

陈教授团队尝试在人黑色素瘤细胞中确定增强MC1R下游信号转导的红发相关蛋白。他们发现脂肪酸分子棕榈酸酯符合这个标准。在棕榈酰化的过程中，棕榈酸酯与蛋白质相连，使蛋白质疏水性增加，与细胞膜之间的相互作用随之增强。这种变化使MC1R靶向细胞膜的难度和时间增加，从而调节受体的活性。

MC1R属于G蛋白偶联受体家族，其细胞信号通路机制与G蛋白受体家族相同。已知许多G蛋白受体可棕榈酰化。虽然之前的研究未发现MC1R可被棕榈酰化，但它附近氨基酸基团羧基末端是特征性的棕榈酰化位点。有证据表明红色和黄色皮肤的小狗MC1R蛋白上的棕榈酰化位点突变，表明该位点是MC1R蛋白重要的功能位点。

陈教授团队证明体外培养的人类细胞中MC1R蛋白可被棕榈酰化。他们发现UV暴露后细胞棕榈酰化反应增加，并且周围的角化细胞会分泌短肽激素α-MSH刺激受体。MC1R棕榈酰化水平增加导致了MC1R介导的黑色素分泌信号传导和激活随之增加。MC1R突变可导致蛋白无法棕榈酰化，无论有无UV刺激都无法激活信号通路。

棕榈酰化由棕榈酰转移酶家族（ZDHHC）介导的。陈教授测试了ZDHHC家族调节MC1R的能力，认为ZDHHC13是调节MC1R棕榈酰化的主要酶。UV暴露后，细胞中MC1R棕榈酰化水平和受体信号传导水平随ZDHHC13的变化而变化。此外，紫外线暴露诱导的DNA损伤可激活ATR酶，使ZDHHC13磷酸化。ZDHHC13的磷酸化导致ZDHHC13和MC1R之间的相互作用增加。这表明紫外线损伤DNA可反过来增强MC1R信号从而刺激DNA修复。然而，上述理论存在一个问题。zdhhc13突变的小鼠似乎没有表现出MC1R缺陷，尽管小鼠毛发生长困难，但其颜色不受突变的影响。也许在体内存在另一个可调节MC1R的ZDHHC家族酶，或者ZDHHC13对DNA损伤的反应非常有限。陈教授团队采用黑色素细胞中含BRAF基因突变的小鼠研究MC1R棕榈酰化的增强是否会影响黑素瘤的形成。结果表明不管是MC1R缺陷的小鼠还是携带常见的MC1R突变的红发人群在UV暴露后比BRAF突变的小鼠更易产生肿瘤。但是如果在紫外线照射之前，给予MC1R突变小鼠增加棕榈酰化作用的小分子，其肿瘤产生慢于对照组小鼠。

研究发现小鼠皮肤黑色素细胞对紫外线的反应可由相邻的角质形成细胞介导。DNA损伤后角质细胞会产生蛋白质p53。反过来，诱导合成α-MSH，随后活化黑色素细胞中MC1R。MC1R突变对UV暴露后产生的DNA损害的影响是多方面的。首先，MC1R突变细胞中α-MSH活性降低，导致黑皮素产生减少，因此不能保护皮肤免受进一步紫外线损伤。第二，MC1R突变后不能刺激黑色素细胞修复DNA，使基因组免受致癌突变的影响。最后，MC1R突变产生更多致癌的黑色素，促进黑色素瘤形成。

MC1R是黑色素瘤的抑癌基因。无论是在野生型或部分功能丧失的突变细胞中，MC1R棕榈酰化水平的增加都可增强其功能。因此增加MC1R棕榈酰化水平是红发人群预防黑色素瘤的一个有效的临床方法。涂抹防晒霜、减少阳光照射是预防皮肤癌的有效措施。但事实上，携带MC1R突变的个体即使紫外线暴露量被控制，其患黑色素瘤的风险仍高于正常人。另一种方法是使用药物增强MC1R下游信号通路，但这会激活黑色素细胞的保护变黑反应。这种影响可能是获得性MC1R突变人群所特有的。前学者报道一些MC1R红发突变个体的信号传导能力下降，因为MC1R不能正确结合在细胞膜上。

从医学角度来看，干预治疗健康个人的常见遗传变异不可取。此外，非红发人群携带单拷贝的突变MC1R基因也有发生黑色素瘤的风险。携带MC1R变异基因的人数超过北欧人口的一半。对这种人口级别的预防性治疗似乎不太可能。但是刺激紫外线损伤后的黑色素细胞中DNA修复是预防黑色素瘤发作的重要理论，特别是在缺乏MC1R的人群中。

有趣的是，许多天然产物含有棕榈酸酯。莲花油中的棕榈酸酯可使黑色素细胞的黑色素生成增强。椰子油也含有丰富的棕榈酸盐，但是传闻椰子油可以美黑？[Jackson IJ,Patton EE.Cell signalling:Red alert about lipid's role in skin cancer[J].Nature,2017,549(7672):337-339.doi:10.1038/nature23550.]

8 棕榈酰依赖性MC1R可预防黑色素瘤的发生

黑皮质素-1受体（MC1R）是一种G蛋白偶联受体，在人和小鼠色素沉着中起重要作用。通过α-黑素细胞刺激激素（α-MSH）激活黑色素细胞中的MC1R，MC1R随之刺激cAMP信号和黑色素生成，并增强紫外线暴露后DNA修复能力。携带MC1R突变的个体通常皮肤白皙不易晒黑，并且得黑色素瘤的风险较高，特别是红发的个体（RHC突变）。然而，紫外线暴露如何调节MC1R活性，红发人群为何更容易出现黑色素瘤以及RHC突变是否可以通过治疗恢复都是未知的。此次研究我们阐述一种潜在的MC1R靶向干预策略，通过激活MC1R蛋白棕榈酰化来治疗MC1R RHC突变中功能丧失的MC1R。MC1R棕榈酰化主要由蛋白质-酰基转移酶ZDHHC13介导。MC1R棕榈酰化对激活MC1R信号通路是必需的，可引起色素沉着、G1期细胞周期停滞以及控制衰老与黑色素瘤的产生。我们采用内源性MC1R缺陷的C57BL/6J-Mc1re/eJ小鼠表达Mc1r RHC突变，棕榈酰化可挽救Mc1r RHC突变的缺陷并防止黑色素瘤形成。结果表明MC1R棕榈酰化在色素沉着和预防黑色素瘤中的重要作用。[Shuyang Chen,Bo Zhu,Chengqian Yin,et al.Palmitoylation-dependent activation of MC1R prevents melanomagenesis[J].Nature,2017，549(7672):399-403.DOI:10.1038/nature23887.]

9 肠癌患者粪便促使无菌小鼠致癌

目的：肠道微生物可导致结肠直肠癌（CRC）发生。一些肠道细菌可产生基因毒素，进而改变免疫应答、肠微环境并激活致癌信号通路来促进肠癌的发生。此研究目的在于明确CRC患者的粪便是否可以直接诱导小鼠结直肠癌的发生。

方法：粪便样本来源于香港宏基因组研究项目的参与者。我们首先用氧化偶氮甲烷（AOM）和抗生素来诱导小鼠产生结直肠肿瘤。随后，我们分别给小鼠移植了结直肠癌患者和健康人的粪便。粪便样本分别来自5个结直肠癌患者和5个健康人。最后我们收集小鼠肠道组织，进行组织学、免疫组化、表达谱、定量PCR、免疫印迹和流式细胞术分析。我们对小鼠粪便进行了16S rRNA基因测序分析。

结果：与对照组比较，CRC患者粪便灌胃的小鼠出现高级别发育不良（P＜0.05）和肉眼可见息肉（P＜0.01）的比例明显升高。此CRC患者粪便灌胃的无菌小鼠的结肠增殖（Ki-67阳性）细胞的比例比对照组更高（P＜0.05）。CRC患者粪便灌胃的小鼠和对照组小鼠的粪便由不同的微生物组成，CRC患者粪便灌胃的小鼠粪便生物丰富度较低。CRC患者粪便灌胃的正常小鼠和无菌小鼠的肠道中炎症细胞因子的表达增加，包括CXCR1、CXCR2、IL17A、IL22和IL23A。CRC 患者粪便灌胃的正常小鼠和无菌小鼠肠道中含有较高比例的Th1细胞（2.25%vs 0.44%）和Th17细胞（2.08%vs 0.31%）（P＜0.05）。RT-PCR发现CRC患者粪便灌胃的小鼠肠道细胞增殖、干性、凋亡、血管发生、侵袭和转移的基因上调。

结论：我们采用CRC患者和健康个体的粪便样本灌胃饲养无菌小鼠和含有氧化甲烷的正常小鼠。与对照组相比，我们发现CRC患者粪便灌胃的小鼠结肠中的粪便数量、肠道发育不良程度、增殖水平、炎症标志物以及Th1和Th17细胞的比例增加。这项研究表明CRC患者粪便中的微生物群可以促进小鼠肠道肿瘤的发生。[Wong SH,Zhao L,Zhang X,et al.Gavage of Fecal Samples From Patients With Colorectal Cancer Promotes Intestinal Carcinogenesis in Germ-Free and Conventional Mice[J].Gastroenterology,2017,153(6):1621-1633.doi:10.1053/j.gastro.2017.08.022.]

10 KLF6表达抑制可激活E2F1并促进肾透明细胞癌的转移

转录因子KLF6在多种癌症的发生和转移中具有重要作用。在原发性转移性肾透明细胞癌（ccRCC）中KLF6的表达降低，然而KLF6表达降低后如何影响恶性肿瘤进展的机制仍不清楚。此次研究中我们证明肾透明细胞癌KLF6表达的降低可促进E2F1介导的EMT和转移能力。人ccRCC小鼠异种移植模型实验证明沉默KLF6可加强肿瘤细胞的增殖和恶性程度，而沉默E2F1的结果完全相反。癌症转移模型动物证实沉默KLF6同时增加E2F1表达导致大量的肺转移病灶产生。针对ccRCC临床标本的分析发现低水平KLF6和高水平E2F1表达与ccRCC发生密切相关。总之，我们的研究结果明确了KLF6-E2F1轴激活在ccRCC中的意义，阐明了导致人类ccRCC侵袭和转移的关键机制。[Gao Y,Li H,Ma X,et al.KLF6 Suppresses Metastasis of Clear Cell Renal Cell Carcinoma via Transcriptional Repression of E2F1[J].Cancer Res,2017,77(2):330-342.doi:10.1158/0008-5472.]

11 人类癌症中高频突变的综合分析

研究纳入＞81 000个儿科和成人肿瘤患者（包括由化疗、致癌物或遗传改变引起的高频突变肿瘤）的测序分析数据，对其突变负荷进行评估。在既往研究未发现大量突变的肿瘤类型中，我们也检测到了高频突变。DNA修复的缺陷是高频突变的主要原因。我们在DNA修复相关的DNA聚合酶、微卫星不稳定性和修复缺陷中发现了新的驱动基因突变。基于突变背景下的临床亚组分析表明不同起源的肿瘤具有相似的向高频突变发展的特性。一些致癌因素可导致意想不到的癌症，包括肉瘤和肺肿瘤。癌症前期治疗及DNA修复缺陷的突变特征的检出可改善患者和家属的管理，且这些数据可用于肿瘤分类、基因检测和临床试验设计。[Campbell BB,Light N,Fabrizio D,et al.Comprehensive Analysis of Hypermutation in Human Cancer[J].Cell,2017,171(5):1042-1056.doi:10.1016/j.cell.2017.09.048.]

12 循环肿瘤DNA对早期癌症的诊断作用

癌症的早期诊断和干预治疗是降低人类癌症发病率和病死率的最有效手段。然而，无创性的早期肿瘤检测方法的开发仍然是一个挑战。我们开发了一种靶向误差校正测序（TEC-Seq）技术，该技术可在大规模并行测序中对循环游离DNA的序列变化进行超灵敏的评估。我们使用这种方法检查58个癌症相关基因。来自44个健康个体的血浆分析发现16%的无症状个体出现与克隆性造血有关的基因组变化，但与实体癌相关的驱动基因没有改变。对200例结直肠癌、乳腺癌、肺癌或卵巢癌患者的评估发现，分别有715 959和68%的Ⅰ或Ⅱ期患者血浆中出现体细胞突变。血液循环中的突变分析结果与这些患者的肿瘤改变高度一致。在可切除的结肠直肠癌患者中，含量较高的术前循环肿瘤DNA与疾病复发和总体生存率降低有关。这些分析为早期肿瘤的无创检测提供了可用于癌症患者的筛查和管理的方法。[Phallen J,Sausen M,Adleff V,et al.Direct detection of early-stagecancersusingcirculatingtumorDNA[J].SciTransl Med,2017,9(403).doi:10.1126/scitranslmed.aan2415.]