液体活检在头颈鳞癌中的研究和应用

张依楠，李梦玮，李 鑫，徐寒梅

随着精准医学和个体化治疗在肿瘤领域的发展，出现了采用肿瘤分子生物学特征进行检测的需求。液体活检技术克服了传统组织活检的高侵入性、取样困难和难以实时监测等局限性，使肿瘤的实时动态监测成为可能。液体活检技术以无创、快捷、可重复等特点得到了广泛关注，在未来有巨大的发展潜力。头颈鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是常见的癌症之一，严重影响患者的生活质量和生存期。作者对液体活检在HNSCC中的研究和应用作一综述。

1 头颈癌与液体活检

头颈部肿瘤是世界上常见的癌症之一，其中HNSCC占90%以上[1]。头颈癌包括起源于唇、口腔、鼻腔、副鼻窦、咽和喉等部位的肿瘤。此疾病可使患者产生生理缺陷，严重影响生活质量。不同部位的肿瘤，发病诱因不尽相同。鼻咽癌主要由Epstein-Barr病毒引起，而口咽癌主要由人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的HPV-16和HPV-18致癌型感染引起。在全球范围内，HPV-16引起的口腔癌发病率最高的国家是中国(81%)，然后分别是印度(74%)、荷兰(63%)、西班牙(47%)、英国(20%)和美国(20%)[2]。HNSCC的发病机制与饮酒、吸烟和高危HPV感染密切相关，其中吸烟者患病的可能性比不吸烟者高10倍[3]。

乳腺癌的5年相对生存率为89%，膀胱癌为77%，结直肠癌为65%,皮肤癌为92%[4]。而头颈癌患者从诊断出疾病到死亡的中位生存时间为1～12个月。患者5年总体生存率为50%左右[1]。头颈癌的高死亡率与诊断较晚和转移有关。大多数患者被诊断为局部晚期疾病，头颈癌远处转移倾向于肺部(66%)、骨骼(22%)、肝脏(10%)、皮肤(>2%)、纵隔(>2%)和骨髓(>2%)等[2]。

成像技术和肿瘤组织活检是目前头颈癌诊断的常用方法。其中成像技术包括磁共振成像、电子计算机断层扫描以及正电子发射型计算机断层显像等。对于难以进入的部位，通常使用超声引导的细针抽吸器对该部位进行取样[5]。患者主要采用手术、放疗和化疗相结合的治疗方式。然而现有的图像技术仍不能满足对肿瘤早期转移和预后监测的需求；肿瘤组织活检存在着取样困难、只有一个样本无法顾及肿瘤异质性、多次取样成本较高、容易造成患者面部毁容等缺陷。因此，迫切需要一种侵入性较小的检测方式来监测患者肿瘤的发生和远处转移，从而提高患者的生存率。

液体活检是指用体液样本代替肿瘤组织进行病理学、分子生物学、免疫学等方面的检测，从而获取疾病信息，帮助疾病的诊断和治疗。液体活检的检测对象包括血液、唾液等体液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、肿瘤细胞来源的外泌体等。液体活检具有微创、自动化完成、可重复、减小肿瘤异质性干扰等优点[6-8]。

2 CTCs与HNSCC

1869年，Ashworth[9]首次发现了肿瘤患者体内存在CTCs，他在血液中检测到了形态异常的细胞，并认为它们来自肿瘤组织，因为它们与实体肿瘤细胞具有相同的形态特征。CTCs是来源于肿瘤组织，可通过主动脱落或被动的上皮-间质转化过程脱落后进入血液循环中的肿瘤细胞。大部分CTCs被机械因素和免疫系统破坏，只有极少部分的CTCs存活下来进入循环系统[10]。进入血液循环的未被清除的肿瘤细胞通过迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶[11]。CTCs是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素[12]。CTCs与肿瘤转移及预后的相关性越来越受到人们的关注。

2.1 CTCs及其检测 1 mL的血液携带大约10亿红细胞、700万白细胞和2.95亿血小板[13]。这对CTCs检测技术的灵敏度和精确度提出了很高的要求。现有多种检测CTCs的方法，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、流式细胞术、微流控芯片、免疫磁性富集法和激光扫描细胞术等。

一种广泛使用的CTCs检测方法是利用细胞标志物来识别。基于此原理，科学家研究出了CellSearch系统[14]。该方法将肿瘤细胞固定并富集在磁珠上，随后通过荧光染料标记细胞核，具有EpCAM+、CK+、DAPI+、CD45-的细胞被界定为CTCs。CellSearch系统自动化程度较高、可同时处理多个样本，并且将免疫荧光标记与免疫磁珠分选富集技术结合在一起，有较高的敏感性、可重复性及特异性[15-16]。2004年，此系统被美国食品和药品监督管理局批准用于临床，是一种标准化的检测方法。该方法已开始用于检测转移性乳腺癌、结直肠癌及前列腺癌患者的CTCs[14]。已有CellSearch系统应用于头颈癌相关研究的报道，EpCAM在口咽癌和喉癌中的表达率为22%～75%，在唾液腺癌中的表达率为83%～100%。CellSearch系统能够以EpCAM阳性细胞的免疫磁性富集为基础从血液中分离头颈癌细胞[15-16]。

Morgan等[17]采用了一种新方法，使用表面增强拉曼光谱散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)纳米技术在白细胞存在的情况下检测目标CTCs。其原理是使用带有表皮生长因子肽的SERS纳米粒子作为靶向配体，来检测在几乎所有的HNSCC中都有表达的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，这使检测的成功率大大提高。SERS技术独特的检测模式，使我们省去了繁琐的分离纯化过程，实现了精准检测。

2.2 CTCs在HNSCC诊疗中的应用 Morgan等[17]采用SERS纳米粒子检测HNSCC患者外周血中的CTCs，发现预测远处转移性疾病进展的最佳临界点是675CTCs/7.5 mL外周血。CTCs数量≤675时，5年无远处转移生存为89%；而CTCs数量>675时，5年无远处转移生存为71.4%。Jatana等[18]对48例HNSCC患者研究发现，未检测到CTCs的患者的无病生存期显著高于对照组(P=0.01)；所检出的CTCs越多，无病生存期越差(P=0.04)。然而，Buglione等[19]在一些癌症中没有发现CTCs的诊断与患者的生存或肿瘤复发之间的相关性。Van de Stolpe等[20]发现CTCs实际上是高度异质性的，仅用CTCs计数来评估疾病的预后是不准确的。而研究具有侵袭性特征的CTCs亚群则具有重要的临床意义。

环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在促进肿瘤细胞增殖、血管新生和侵袭能力，抑制细胞凋亡等方面发挥着重要作用[21]。研究表明，鼻咽癌患者治疗后CTCs中COX-2的表达与治疗不良反应、更高的肿瘤复发和转移风险密切相关。如果患者治疗后检测出CTCs中表达COX-2，则为预后总生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(progression-free survival，PFS)较低。根据COX-2的表达情况来积极调整临床治疗方案，从而提高鼻咽癌患者生存率[22]。

平足蛋白(podoplanin，PDPN)与EpCAM在CTCs中的表达是HNSCC的预后因素之一。Hsieh等[23]随访HNSCC患者6.6～18.5个月后发现，若PDPN+/EpCAM+-CTCs>20%是HNSCC患者在6个月内死亡的重要预后因素(P=0.011)，与不良PFS(P=0.016)和OS(P=0.015)相关。PDPN+/EpCAM+-CTCs比率，在临床上有一定的参考价值。

Strati等[24]研究发现，HNSCC患者在放化疗治疗结束时，CTCs过度表达程序性细胞死亡蛋白配体-1(programmed death-ligand 1，PD-L1)的患者PFS(P=0.001)和OS较低(P<0.001)。多变量分析显示，治疗结束时PD-L1过度表达是PFS和OS的独立预后因素。

3 ctDNA与HNSCC

肿瘤细胞凋亡或坏死后将ctDNA释放到血液中[25]。ctDNA主要来源于原发性肿瘤、CTCs、微转移灶及转移灶。ctDNA通过肝脏、肾脏等快速清除，半衰期从16 min到数小时，虽然这带来检测上的挑战，但是能够反映肿瘤的实时变化状态。一些ctDNA通过与蛋白结合的形式存在，从而减少了血浆核酸酶对ctDNA的作用，使其避免被快速降解。ctDNA包含与其同源肿瘤细胞相同的基因缺陷，例如点突变、基因重组甚至基因拷贝数的变异等[26]。ctDNA的研究主要是其作为非侵袭性标志物的可能性，以及其表达水平与肿瘤复发转移的关系[27]。ctDNA水平与肿瘤负荷程度呈正相关，这在肿瘤检测中得到了很好的应用[28]。

3.1 ctDNA及其检测 由于ctDNA浓度低而且高度碎片化，因此，要尽量提高分离和富集效率。从血浆中分离和富集ctDNA的方法有吸附柱法和磁珠法。ctDNA检测主要利用ctDNA突变基因和ctDNA的甲基化[29]。随着二代测序技术的发展，ctDNA检测和分析方法发生了巨大变化。用于分析ctDNA的主要方法是通过PCR扩增ctDNA基因靶标，然后进行下游分析。此外有多种方法用于点突变的灵敏检测，包括实时定量PCR，数字液滴PCR和Sanger测序等。ctDNA的甲基化检测方法较多，包括高效液相色谱法、甲基化特异性PCR、甲基化间位点扩增等[30]。

Wang等[31]对47例HNSCC患者的研究，发现87%的患者能够检测到具有肿瘤特异性点突变的血浆ctDNA。血浆ctDNA检出率在不同部位肿瘤之间无显著性差异(口腔80%、口咽91%、喉86%和下咽100%)。而唾液ctDNA检出率，口腔肿瘤患者(100%)与其他部位肿瘤患者(47%～70%)差异显著。唾液优先富集来自口腔肿瘤的ctDNA，而血浆则富集来自各个部位的ctDNA。当结合血浆和唾液中脱落的DNA片段检测结果时，诊断灵敏度提高到96%。将血浆和唾液ctDNA检测结合起来是提高检测灵敏度的有效策略。

3.2 ctDNA在HNSCC诊疗中的应用 目前已发现一些HNSCC唾液和血浆ctDNA的生物标志物，如TP53、PIK3CA、FBXW7、CDKN2A等[32]。Mazurek等[33]发现ctDNA浓度、淋巴结状态(N0-1对N2-3)、分期(Ⅰ-Ⅲ对Ⅳ)和年龄(<63和>63)之间存在显著相关性。

ctDNA检测可发现患者携带的肿瘤相关单核苷酸变异、拷贝数改变及结构变异等遗传学改变。Mydlarz等[34]评估了来自100名HNSCC患者和50名健康体检者血清DNA甲基化的水平。在10%HNSCC患者的血清中鉴定出内皮素受体B基因高甲基化。血清内皮素受体B基因高甲基化是高度特异性但不敏感的HNSCC血清生物标志物。Schröck等[35]通过对141名HNSCC患者血浆中的SHOX2和SEPTIN9 DNA甲基化情况进行量化监控，发现来自血浆的ctDNA中SHOX2和SEPTIN9 DNA甲基化水平是临床上有价值的生物标志物，敏感性52%、特异性95%。

ctDNA检测可用于疾病的早期诊断和疾病复发的监测。在一项对47名HNSCC患者的研究中，Wang等[31]发现可检测到口腔癌患者肿瘤产生的ctDNA，并且75%的口腔癌患者处于癌症的早期阶段(Ⅰ或Ⅱ)；肿瘤的尽早诊断可以为临床决策提供依据，提高患者的生存率；收集了9例HNSCC患者的术后治疗样本，5例ctDNA阴性患者平均随访12个月均无复发，3例ctDNA阳性患者发生了疾病复发；与临床放射学检查相比，血浆ctDNA检测能够帮助医生更早发现疾病复发。

4 外泌体与HNSCC

外泌体发现并命名于1986年[36]。外泌体是直径30～100 nm的囊泡，与质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体包含多种蛋白质、mRNAs和miRNAs。外泌体被认为具有多种功能，能够与细胞微环境相互作用，参与了信号传递、细胞募集、免疫应答和遗传物质的转移等多种生理过程，是一种重要的细胞间物质和信息交流工具[37]。外泌体可由机体中的多种细胞分泌，并广泛分布于唾液、血浆和乳汁等体液中[38-39]。肿瘤细胞分泌大量外泌体，来与周围基质组织沟通，激活增殖和血管生成途径，参与转移前部位的形成，从而促进肿瘤的发展。因此，外泌体是肿瘤微环境的重要组成部分，目前被认为是促进肿瘤发展和转移的主要因素之一[37]。

4.1 外泌体分离及其检测 从细胞培养上清液和不同体液中分离并富集外泌体有多种方法[40]。首先，从体液或细胞培养上清液中通过2 000 r/min离心去除死细胞；然后，在10 000 r/min离心时去除细胞碎片；接着，用含有外泌体的上清液通过200 nm的过滤器将所有尺寸在200 nm以上的较大粒子分离开来；最后，进一步分离纯化外泌体，如：超速离心、等密度离心、免疫亲和分离、尺寸排阻色谱等[41]。超速离心法以沉降系数为基础，转速大于100 000 r/min，分离出外泌体，适用于低成本大量样品的分离[42]。密度梯度离心采用蔗糖等梯度介质分离外泌体，为蛋白质组学等分析提供了优质材料[41]。

分离后的外泌体可以采用多种分析方法，如：透射电子显微镜、流式细胞术、Western Blot等进行完整性、大小、密度、已知阳性标记等方面的检测[43]。Sharma等[44]利用一种新的、超灵敏的原子力显微镜对人唾液外泌体进行了结构力学和生化表征研究。

4.2 外泌体在HNSCC诊疗中的应用 外泌体在免疫抑制和检测癌症进程中发挥着重要的作用。Theodoraki等[45]从HNSCC患者血浆中分离出了携带PD-L1的并可以抑制T细胞功能的外泌体。与疾病早期患者相比，疾病晚期患者血浆中有较高的PD-L1+外泌体水平，并且抑制CD8+T细胞活化的能力更强。外泌体携带的PD-L1水平与HNSCC患者的疾病进程、分期及淋巴结状况有关，是反映HNSCC患者疾病和免疫活动的重要指标。

外泌体所携带的miRNA也被用于HNSCC的诊断中。Manikandan等[46]比较不同疾病分期的口腔鳞癌患者和口腔良性肿瘤患者血浆中5种外泌体miRNA表达水平，发现早期、晚期口腔鳞癌患者外泌体中miR-29b、miR-142-3p、miR-144、miR-203及miR-223表达水平之间有显著差异，表明外泌体miRNA的表达水平与口腔鳞癌分期有关。

外泌体miRNAs可成为HNSCC预后的生物标志物。Ye等[47]研究发现外泌体miR-24-3p通过靶向成纤维细胞生长因子11阻碍T细胞功能，并且可以作为鼻咽癌的潜在预后生物标志物。这些研究证明外泌体miRNAs在未来可作为癌症诊治的一种有价值的工具。

Sanada等[48]分析了36例HNSCC患者和7名正常人的血清样本中外泌体LOXL2蛋白的水平，与健康对照相比，HNSCC患者的平均LOXL2水平高出9倍，统计分析显示血清外泌体LOXL2水平升高与HNSCC之间存在相关性，表明LOXL2有可能成为HNSCC的潜在的治疗靶标。

此外，肿瘤微环境中外泌体能够诱导周围肿瘤细胞增强耐药能力。例如，耐受顺铂的口腔鳞癌细胞OSC-19-R能产生大量携带P糖蛋白的外泌体。而P糖蛋白是肿瘤细胞耐药基因MDR1的表达产物，可与抗癌药物结合，并将药物从细胞内泵出细胞外，从而降低肿瘤细胞内的药物浓度，使肿瘤细胞产生耐药[49]。

5 结语

随着经济和医疗水平不断发展，人们对疾病的诊断和治疗提出了更高的要求。传统肿瘤组织活检标本检测为侵入性操作，具有操作复杂、患者痛苦、价格昂贵等缺点。而液体活检与传统检查方法相比，创伤小、易被患者接受，在肿瘤早期诊断、治疗监测、复发预后等方面有着不可替代的优势。

但液体活检仍然存在一些局限性。例如，CTCs丰度低，需要进一步提高检测的灵敏度；ctDNA仅含有肿瘤基因组的信息；外泌体检测时容易受到其他囊泡的干扰，需要完善分离鉴定技术；液体活检缺乏统一的分离检测和分析标准等[50]。液体活检技术虽然应用前景广泛，但目前尚不能很好地应用于HNSCC的临床实践当中[51]。因此，要将液体活检与临床实践紧密结合，通过大规模临床研究来验证其用于临床常规筛查的实用性，并建立癌症患者的新型标志物样本数据库[52]。随着检测技术的成熟和诊断标准的建立，液体活检有望应用于更多种类疾病的全面检测。例如，分离出来的血浆可以进行ctDNA或RNA的检测，分离出来的病原细胞或白细胞可以进行细胞类型的鉴定以及细胞所携带的各种生物组学、转录组学、蛋白质组学等信息的检测。通过对多种检测结果的综合分析，描绘出一个完整的疾病信息图谱。随着技术的成熟和诊断标准的建立和优化，液体活检在HNSCC诊治中将具有更广泛的应用前景。