巨噬细胞炎性微环境对肿瘤发生发展作用的研究进展

孙艳 潘文胜 张骏

随着肿瘤患者日趋增多，临床上各种新的抗肿瘤治疗方法不断涌现。以往抗肿瘤治疗的重点在于肿瘤细胞本身，但是肿瘤的发生、发展还受到其周围细胞因子、炎症反应等微环境的影响。早在19世纪就有学者提出肿瘤可在炎症的基础上产生，直至近10年才有学者将肿瘤相关炎症列为癌症标志之一[1]。目前很多抗肿瘤研究重心向肿瘤生存的微环境转移，期望通过调控微环境中各种因素，对致瘤过程进行早期干预[1-2]。巨噬细胞是体内广泛分布的炎症反应细胞之一，参与调控肿瘤微环境。巨噬细胞有M1和M2两种表型，不同表型的巨噬细胞在肿瘤各个阶段所占比例及发挥的作用各不相同。虽然浸润在肿瘤组织的巨噬细胞更多被认为是M2型[3-4]，也有不少研究发现肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与M2型巨噬细胞并不完全一致[5]。本文以TAMs为切入点，阐述其对肿瘤发生、发展的影响。

1 TAMs的来源及表型

人体组织中大多数巨噬细胞由骨髓祖细胞发展而来，在外周血中分化成单核细胞，最后迁移到不同的组织或补充特异性巨噬细胞（如肺泡巨噬细胞和库普弗细胞），这一途径是多数TAMs的来源[6]。另外，部分组织巨噬细胞也来源于卵黄囊祖细胞，在肿瘤发生、发展过程中，通过原位增殖来补充TAMs细胞群的数量。有研究发现脾、胰及脑组织等非骨髓来源的TAMs尽管数量较少，但在肿瘤进展过程中发挥着举足轻重的作用[7-9]。

巨噬细胞有M1和M2两种表型。M1型具有促炎及抗肿瘤效应；M2型通常被认为是TAMs的表型，具有免疫抑制、促肿瘤血管生成等作用，被认为是一种促肿瘤细胞[3-4]。Yamaguchi等[4]检测胃癌患者腹腔中的TAMs，发现其高表达M2型标志物的mRNA[如IL-10、血管内皮生长因子（VEGF）-C、VEGFR等]和低表达M1型标志物的信使RNA（如TNF-α、CD80和CD86等）。使用培养过鼠胰腺癌肿瘤细胞的上清液对幼稚巨噬细胞进行培养，发现其向M1型转变较少，M2型转变增多，且培养过M2型巨噬细胞的上清液能诱导胰腺癌肿瘤细胞的体外生长[10]。然而，也有研究认为TAMs是一群独特的细胞，它共享M1型和M2型巨噬细胞的特征[5，11]。Hattermann 等[11]一项体外实验结果发现，对于M1型标志物，TAMs高表达IL-6，低表达IL-1β和TNF-α；对于M2型标志物，TAMs高表达IL-10，低表达CD163和TGF-β。这表明TAMs不隶属于M1型或M2型巨噬细胞群，但偏向于M2型。由于TAMs存在于非稳态的肿瘤环境中；因此，肿瘤的类型及分期、TAMs来源及其所处的微环境都可能影响其表型。虽然TAMs表型的研究尚未形成定论，但现今科学研究仍将M2型的一系列分子标志物用于TAMs的特异性标记。

2 肿瘤组织中TAMs的募集

集落刺激因子（CSF）-1和趋化因子配体（CCL）2是经典的巨噬细胞募集趋化剂。其中CSF-1能刺激巨噬细胞的增殖和分化，同时具有募集作用，被认为是TAMs浸润的关键介质。Aharinejad等[12]发现过表达的CSF-1可增加TAMs的募集。针对CSF-1/CSF-1R靶向治疗的研究表明，抑制CSF-1或CSF-1R，能诱导消退或抑制多种肿瘤的生长[13]。CCL2是最先被发现的肿瘤衍生的趋化因子，与肿瘤组织中TAMs募集密切相关，它通过抑制Caspase-8裂解和增强自噬活性来保护已募集的单核细胞[14]。中和CCL2抗体或CCL2 shRNA沉默CCL2的表达，能减少TAMs募集并抑制肿瘤的生长、浸润和转移。其他趋化因子如CCL3、CCL5、CCL18、CXCL8、CXCL12 等，也参与了 TAMs的募集[15-17]。CXCL12与VEGF-A协同促进缺氧诱导的巨噬细胞募集，且两者共同受低氧诱导因子（HIF）-1α的调控[17]。此外，TAMs的募集也与一些特殊蛋白密切相关，如警报蛋白（S100A8、S100A9）、血清淀粉样蛋白 A3等能促进CD11b+髓样细胞募集至肿瘤组织[16]。

TAMs的募集涉及多种化学诱导物，其能协同加速单核/巨噬细胞募集至肿瘤组织。因此，研制多激酶抑制剂（如CS2164）可能是一种阻断TAMs在肿瘤部位募集进而抑制肿瘤发生、发展的方法[13]。事实上，由于肿瘤微环境中各种募集因子种类繁多且相互影响，因此对于肿瘤微环境中TAMs募集的具体调控网络仍需进一步研究。

3 TAMs在肿瘤进展中的作用

3.1 TAMs与肿瘤血管生成 肿瘤血管生成在肿瘤生长、浸润和转移方面起着重要作用。其中，低氧是肿瘤血管生成的主要驱动因子。Laoui等[18]发现位于肿瘤低氧区低表达MHCⅡ的TAMs能上调低氧调节基因，增加促血管生成基因（如VEGF-A）的表达。在很多肿瘤中发现，TAMs数量与微血管密度、VEGF-A的表达密切相关[18-19]。TAMs除了直接促进VEGF-A的表达外，还间接通过HIF-1α、TGF-β1和CSF-1等上调VEGF-A。稳定HIF-1α亚基及其核定位能激活VEGF靶基因[20]。TGF-β1借HIF-1α/β和Smad3/4依赖性机制促进小鼠TAMs表达VEGF-A，而CSF-1通过激活NF-κB来诱导VEGF-A的表达，与CCL2一同促血管生成[21-22]。TAMs释放的其他促血管生成因子，包括TNF-α、IL-1β、胸苷磷酸化酶（TP）、信号素 4D（Sema4D）、前列腺素（PG）E2和基质金属蛋白酶（MMP）等，促进肿瘤血管生成。其中TAM起源的TNF-α和IL-1β可促进结肠癌血管生成素mRNA的表达，前者可上调肿瘤细胞促血管生成酶TP的表达，后者在Lewis肺癌中凭借NF-κB和c-Jun通路诱导MMP-9等因子分泌[23]。Sema4D通过诱导内皮细胞运动参与肿瘤血管生成及侵袭性生长的调控[24]；PGE2能增加血管通透性，有利于营养物质的运输，从而促进肿瘤生长。MMP-9、MMP-2等还能通过降解细胞外基质，促进血管内皮细胞、肿瘤细胞的迁移，加快血管生成和肿瘤转移[25]。

然而，也有研究发现粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子处理的TAMs能表达VEGF的可溶性受体（sVEGFR-1）[26]，也可通过稳定HIF-2α来增加sVEGFR-1的表达[27]；而sVEGFR-1通过阻断VEGF-A的生物活性，从而抑制血管生成。目前关于TAMs在抗血管生成方面的研究相对较少，如何靶向调控抑制血管生成因子的表达从而部分拮抗或平衡TAMs微环境导致的肿瘤血管生成，可能是未来研究的方向。

3.2 TAMs与淋巴管形成 淋巴管生成在肿瘤淋巴转移中起着重要作用。目前TAMs产生的VEGF-C和VEGF-D被认为在诱导淋巴管生成中起着关键作用。在胆囊癌模型中，Yang等[28]发现TAMs通过表达VEGF-C和VEGF-D诱导淋巴管生成和肿瘤淋巴管转移；使用可溶性的VEGFR-3阻断VEGF-C/D以及使用氯膦酸盐脂质体清除TAMs，能明显减缓上述进程。此外，TAMs来源的 TNF-α、TGF-β和 VEGF-A还能通过上调VEGF-C的表达来促进淋巴管生成[29-30]。

此外，TAMs还分泌 MMPs（如 MMP-9、MMP-2）、丝氨酸蛋白酶和组织蛋白酶，通过调节基质重塑来促进淋巴管内皮细胞（LECs）的迁移，间接调节淋巴管的生成[25]。其中VEGFR2+LECs的增殖和迁移也受促血管生成因子VEGF-A的调节，诱导皮肤癌前哨淋巴结淋巴管形成[30]。TAMs除了促进LECs的迁移，还具备分化成LECs的潜能。目前在TAMs上发现了 VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、Prox-1、Tie2 等 LECs标志物[31]。用手术诱发动物角膜炎症时发现CD11b+/LYVE+和CD11b+/Prox-1+细胞募集，且在新形成的淋巴结构检测到上述细胞的存在[31]。

3.3 TAMs与肿瘤上皮间质转化（EMT） EMT是极化的上皮细胞转变成间充质样细胞的过程。在转换过程中，细胞表面上皮标志物如E-钙黏蛋白、桥粒斑蛋白等表达下调，而间质标志物如N-钙黏蛋白、波形蛋白等表达上调，使其丧失了细胞间的黏附力和顶端-基部的极性，促进肿瘤的进展和转移。研究表明，TAMs可通过表达 IL-1β、TNF-α 以及激活 Gas6/Axl，经 NF-κB 通路和（或）PI3K/Akt/GSK-3β 增加蜗牛蛋白（Snail）的转录，或者阻断Snail的泛素化和降解，抑制E-钙黏蛋白的表达进而诱导EMT[32-34]。

TAMs表达的TGF-β1能激活TGF-β信号通路，依靠Smad依赖性或Smad非依赖性两种信号途径诱导EMT。TGF-β1分泌后可通过自分泌的方式发挥作用，激活TGF-β通路，形成正反馈，维持正在进行EMT转化的肿瘤细胞的间充质特性。使用索拉非尼抑制TAMs释放TGF-β时，能减缓EMT进程[35]。TAMs来源的IL-6借助TGF-β通路参与EMT，IL-8则通过Jak2/STAT3/Snail信号通路促进EMT[36-37]。

TAMs通过分泌多种细胞因子，经相关的信号通路在EMT进程中发挥作用。它对EMT的调控网络十分复杂，具体的调控机制需要进一步研究加以明确。

3.4 TAMs相关的肿瘤免疫抑制 肿瘤免疫抑制有助于肿瘤细胞逃逸免疫监视，在肿瘤进展与浸润转移中发挥重要作用。肿瘤细胞和TAMs产生的IL-10被认为是与癌症相关的有效免疫抑制性细胞因子。高表达IL-10的TAMs可能调节适应性Th2免疫，表现出抗炎和组织重塑功能，且与肺癌的恶性生物学行为有关[38]。TAM衍生的IL-10能抑制IL-12的表达，削弱NK细胞的细胞毒性。另外，在肿瘤衍生因子作用下TAMs产生的TGF-β和PGE2也抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的功能，协助Th1和Th2 CD4+细胞建立自我免疫抑制的肿瘤微环境，其中TGF-β信号传导也能削弱NK细胞的细胞毒性[39]。IL-10还能以自分泌的方式诱导程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的表达，进而抑制抗肿瘤细胞CTL的功能[40-41]。Harada等[42]研究发现，TAMs浸润与胃腺癌细胞中PD-L1表达的上调有关；存在于T细胞中的PDL1与在肿瘤细胞和TAMs中的配体（PD-L1和PD-L2）相结合，能抑制T细胞对肿瘤的免疫反应；尤其是使用CSF1/CSF1R阻断剂时，能降低PD-L1表达并解除CTL对肿瘤应答的抑制作用。TAMs分泌的一系列细胞因子能抑制肿瘤微环境中抗肿瘤效应细胞的功能，诱导形成自我免疫抑制的肿瘤微环境，从而有利于肿瘤进展与浸润转移。

3.5 TAMs与预后 目前，TAMs的浸润与许多癌症患者的预后密切相关，且与特定的细胞表面抗原类型（如 CD163+、CD204+）及其浸润数量有关。分别对CD204+、CD206+、CD163+TAMs高度浸润的肿瘤患者进行生存分析，发现这类患者有着较低的无病生存期、无进展生存期、总生存期和恶性程度较高的肿瘤表型及生物学行为[43-44]。在临床上也发现预后较好的Ⅰ型乳头状肾细胞癌中仅不到30%的TAMs表达CD163，而预后较差的Ⅱ型乳头状肾细胞癌中TAMs基本上都表达CD163[45]。

然而，部分TAMs表面抗原与肿瘤预后的关系尚有一定的争议。对CD68+TAMs高浸润的乳腺癌患者进行单因素分析，发现这类患者的肿瘤特异性存活率和无病生存期较短；但多因素模型分析发现CD68+并非独立的预后指标[46]。在霍奇金淋巴瘤中也证实CD68+TAMs浸润数量与完全缓解、无进展生存期等预后指标无明显关联[47]。上述相悖的结果，可能与普通巨噬细胞也表达CD68有关[48]，检测时包括了有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞。不同表面抗原的TAMs及其浸润数量与肿瘤恶性浸润程度、患者预后等密切相关，可作为评估指标。

3.6 TAMs作为治疗靶点的抗肿瘤研究 目前，肿瘤微环境是抗肿瘤治疗的切入点，靶向肿瘤微环境中的TAMs有希望成为新抗肿瘤方法的方向。使用氯膦酸盐脂质体清除TAMs，能抑制肿瘤血管、淋巴管生成和转移[28]。另外，阻断单核巨噬细胞的募集也是有效的抗肿瘤方法。CSF-1R抑制剂包括小分子（如伊马替尼、尼罗替尼、PLX3397）和单克隆抗体RG7155，能阻断TAMs的募集，也是抗肿瘤方法之一[49]。除了针对TAMs本身，还能通过解除TAMs对抗肿瘤CD4+、CD8+T细胞的免疫抑制作用，达到肿瘤治疗的目标。He等[50]发现小分子疗法有望成为肿瘤免疫疗法的有效方法，化合物9#抑制Jak2-STAT3信号通路，增加CD4+、CD8+T细胞的抗肿瘤活性；检查点抑制剂是目前临床试验的热门，先天性免疫激活剂Toll样受体（TLR）7、TLR9激动剂可增强TAMs的抗原提呈能力来增加活化的CD8+T细胞数量，抗PD-1治疗能增加CD8+T细胞的T细胞表面受体（TCR）克隆性，两者都能诱导肿瘤特异性、适应性免疫应答，抑制肿瘤生长与转移[51]。目前发现纳米药物具有更强的穿透性及组织停留能力，该药的研制有希望更精准地靶向阻断TAMs，是未来靶向药物发展的方向[52]。

与传统的抗肿瘤治疗相比，针对TAMs的抗肿瘤治疗，具有治疗靶点多、穿透性及组织停留能力强等优势，可降低对正常组织的伤害和不良反应；但仍有一定的局限性。TAMs没有特异性的表面抗原，难以被高特异性识别；在正常人体中，巨噬细胞具备清除突变或异常细胞的能力；另外，抗TAMs治疗一旦终止，TAMs会迅速反弹，削弱抗肿瘤治疗效果[53]。

4 总结与展望

巨噬细胞/TAMs在肿瘤形成前后起着重要作用。TAMs能促进肿瘤血管、淋巴管生成和EMT进程，且能抑制肿瘤免疫并与肿瘤的恶性表型及预后密切相关。其中TAMs通过VEGF-A在肿瘤血管、淋巴管及EMT进程的各个阶段发挥着作用，已成为抗肿瘤靶向药物研究的重要靶标。目前对于TAMs表型的研究尚未形成定论，精确标记TAMs仍是亟待解决的问题；少量非骨髓来源的TAMs在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用以及TAMs特定条件下向LECs分化的潜能，可能成为今后TAMs相关致瘤炎性微环境新的研究热点。