舒尼替尼治疗膝骨性关节炎大鼠的实验研究

吴柯 王金杰 庄汝杰

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是临床上常见的退行性疾病，最常见于中老年人群。调查显示，我国40岁以上人群KOA患病率达28.7%[1]。目前关于KOA的病因及发病机制尚未完全阐明，可能由于机械力分布失衡或负荷过度引起软骨磨损，或其他理化因素使软骨细胞代谢异常[2-4]。相关研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）在KOA的发生、发展过程中发挥着重要作用，且证实VEGF会影响软骨细胞增殖、凋亡和代谢，刺激释放基质金属蛋白酶（MMP）及其他代谢介质来降解软骨基质[5-6]。本研究建立KOA大鼠模型，并使用VEGF靶点抑制剂舒尼替尼进行干预治疗，观察其关节液炎症因子表达水平变化，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 4～5月龄的健康SD雄性大鼠32只，体重（190±10）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。随机分为4组，即空白组、4周治疗组、8周治疗组、对照组，每组8只。4组大鼠在相同条件下笼养，自由摄食、饮水，室温控制在18～22℃。KOA建模方法：在常规无菌下，从冰箱取出木瓜蛋白酶静置30min，将4g木瓜蛋白酶溶解于100ml 0.9%氯化钠注射液，充分振荡、混匀。大鼠麻醉后，仰卧位固定于木板上，剃去左右膝关节腔周边1cm区域腿毛，络合碘消毒，体积分数75%乙醇脱碘，大鼠屈曲45°，以髌骨下极髌腱外缘为进针点，向髁间窝方向进针，抵达股骨髁后回撤2mm，注入0.2ml配制好的木瓜蛋白酶0.9%氯化钠注射液（在第1、3、5天各1次），2周后KOA模型建立[7]。空白组：大鼠不造模、不给药。4周治疗组：造模成功后，大鼠灌胃舒尼替尼（1mg/kg，100mg溶于100ml的0.9%氯化钠溶液中，1ml/kg），1次/d，持续4周。8周治疗组：造模成功后，大鼠灌胃舒尼替尼（1mg/kg，100mg溶于100ml的0.9%氯化钠溶液中，1ml/kg），1次/d，持续8周。对照组：造模成功后，大鼠灌胃0.9%氯化钠溶液（1ml/kg），1次/d，持续8周。

1.2 主要试剂及器材 木瓜蛋白酶（P3250-25g，规格25g，美国 Sigma公司）、舒尼替尼（HY-10255A，规格200mg，美国MCE公司）、ELISA试剂盒（武汉新启迪生物科技有限公司）、电子恒温箱（HPX-9052 MBE，上海博迅实业有限公司）、台式离心机（SORVALL，德国Heraeu公司）、酶标仪（DNM-9602，北京普朗新技术有限公司）。

1.3 关节液VEGF、IL-6、IL-33表达水平的检测 实验结束后（第8周）脱颈处死大鼠，切开双膝关节腔，用1ml 0.9%氯化钠溶液冲洗关节腔并收集为关节液标本，4 000r/min离心5min，提取上清液，置于-20℃冰箱内密封保存。采用ELISA法检测大鼠关节液VEGF、IL-6、IL-33表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件。计量资料用 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠关节液VEGF表达水平比较 4周治疗组、8周治疗组、对照组和空白组大鼠关节液VEGF表达水平分别为（168.43±47.47）、（136.75±27.48）、（237.95±69.10）、（152.26±31.17）pg/ml，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较发现，4周治疗组、8周治疗组大鼠关节液VEGF表达水平均明显低于对照组（均P＜0.05），8周治疗组大鼠关节液VEGF表达水平明显低于4周治疗组（P＜0.05）。提示舒尼替尼能降低大鼠关节液VEGF表达水平，长时间用药能使关节液VEGF维持在较低水平。

2.2 4组大鼠关节液IL-6表达水平比较 4周治疗组、8周治疗组、对照组和空白组大鼠关节液IL-6表达水平分别为（36.88±9.81）、（33.16±5.51）、（41.13±13.12）、（26.92±9.40）pg/ml，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较发现，8周治疗组大鼠关节液IL-6表达水平明显低于对照组、4周治疗组（均P＜0.05），4周治疗组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示舒尼替尼长时间用药能降低大鼠关节液IL-6表达水平。

2.3 4组大鼠关节液IL-33表达水平比较 4周治疗组、8周治疗组、对照组和空白组大鼠关节液IL-6表达水平分别为（40.36±14.75）、（35.22±9.13）、（53.68±21.73）、（25.88±11.39）pg/ml，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较发现，4周治疗组、8周治疗组大鼠关节液IL-33表达水平均明显低于对照组（均P＜0.05），8周治疗组大鼠关节液IL-33表达水平明显低于4周治疗组（P＜0.05）。提示舒尼替尼能降低大鼠关节液IL-33表达水平，长时间用药可持续降低关节液IL-33表达水平。

3 讨论

KOA是一种退行性疾病，以关节软骨退行性变、骨赘形成、滑膜炎症为主要特征，常见于中老年人。在严重情况下，关节周围的骨及软组织结构发生改变，可能导致关节疼痛、肿胀、畸形或残疾[8]。目前关于KOA病因及发病机制尚未完全阐明。KOA进展可能与炎症有关，而所有关节炎症的共同特征是滑膜炎。

滑膜中新生血管增多，VEGF表达水平上升均与滑膜炎有关。VEGF家族是一类多功能的细胞因子，在血管及淋巴管生成中具有直接或间接的调控作用，可促进内皮细胞增殖及血管生成，增加血管通透性[9]。此外，VEGF是骨发育的重要介质。当VEGF发生作用时，新生神经及血管一同进入软骨、新生骨赘中，促进骨膜炎症的浸润，从而加重患者疼痛感[10-11]。新生血管刺激炎症反应生成，而炎症反应又促进血管生成；在这过程中，VEGF起着重要作用[12]。同时，VEGF还能上调关节软骨细胞MMP表达水平，从而导致软骨变性。IL-6是一种促炎症因子，它在KOA患者中表达水平明显上升[13-14]。IL-6由软骨细胞和滑膜成纤维细胞分泌并交叉调节介导[15]，可诱导IL-1增加MMP的合成，抑制蛋白多糖产生[16]。IL-33是IL-1受体家族成员ST2的唯一已知配体，它通过与ST2的结合来参与活化MyD88/NF-κB信号通路，诱导肥大细胞、Th2细胞因子产生。ST2/IL-33信号通路参与多种炎症免疫过程并起着关键作用。

舒尼替尼是一种多靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂，其作用靶点包括 PDGFR（PDGFRα、PDGFRβ）、VEGFR（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）等。舒尼替尼能阻断这些信号通路，目前被广泛用于抗肿瘤治疗的实验。本实验结果显示，舒尼替尼能降低大鼠关节液VEGF表达水平；长时间用药能使关节液VEGF维持在较低水平，且降低IL-6、IL-33表达水平。

综上所述，舒尼替尼对KOA大鼠模型具有治疗作用，本研究结果为舒尼替尼作为防治KOA的新型药物提供了实验基础。