流通池法测定消糜栓5种成分溶出度的研究

韩 煦 ，皮佳鑫 ，张 瀛 ，王舒雅 ，张 兵 ，李 雯 ，刘志东

（1.天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程中心，天津 300193；2.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津 300193）

随着新型栓剂的不断涌现，有关于栓剂溶出度的研究也越来越受到人们的重视，溶出度在一定程度上反映了有效成分从制剂中溶出的程度，栓剂中主药的粒度、基质的比例等均是栓剂溶出速率的重要影响因素，因此栓剂的溶出度对于栓剂的处方设计、质量评价等方面均具有重要意义[1]。国内对于传统栓剂的体外溶出度测定研究主要应用《中华人民共和国药典》收载的溶出度测定法桨法、篮法、小杯法[2]，然而传统的溶出方法在测定栓剂溶出度方面存在许多问题，例如样品漂浮问题、无法真实模拟腔道给药环境等[3-4]。

流通池法是一种针对传统溶出度测定方法不足建立起来的新型溶出度测定方法：其克服了传统溶出度测定法方法因缺乏下沉条件所引起的偏差、在测试过程中可以改变pH条件、能够通过溶媒的不同流动方式真实模拟体内的环境[5-6]。流通池法具体分为开环式和闭环式两种，开环式流通池可以保证大量新鲜的溶出介质不断接触被测样品，所以非常适用于一些大剂量、难溶性药物溶出度的测定；闭环式流通池是将样品固定在特定的样品架上，通过恒流泵入小剂量的溶出介质，使介质与样品不断接触，适用于缓控释制剂、植入剂、贴剂、栓剂、脂质体等的溶出度测定[7-9]。近年来流通池法越来越广泛成为一些新剂型药物溶出度的测定方法，国内外许多研究相继报道了流通池法测定溶出度可以更好的获得体内外相关性[10-12]，这对于通过考察药物体外释放特征，预测在体内的作用特征，从而指导临床应用具有至关重要的作用。

消糜栓是一种在腔道内起局部作用，用于治疗女性阴道炎的的药物，含有苦参、黄柏、紫草、儿茶、人参茎叶总皂苷、枯矾、冰片等主要成分，具有起效快，生物利用度高等特点，临床上已被应用广泛[13]，但相关质量研究较为匮乏。笔者在前期建立了改良小杯法测定消糜栓的溶出度实验方法，并测定了苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱5种指标成分。笔者进一步应用流通池法进行中药栓剂消糜栓5种指标成分的溶出度研究，以考察流通池法对于消糜栓溶出度测定的适应性，评价不同溶出介质、不同流速下消糜栓中指标成分的溶出度特性。

1 仪器与材料

LC-20A岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司），Sotex CE7 Offline流通池溶出仪（瑞士Sotex公司）；BPll0S分析天平（德国Sartorius公司）；XP205十万分之一天平（Mettler Toledo）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore）；SB-3200D数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。消糜栓（通药制药集团股份有限公司，批号：171101），苦参碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110805-200508），儿茶素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110877-201203），表儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110878-200102），盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110713-201212），人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110754-201324），其他化学试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 溶出介质中5种成分的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0．05%磷酸水（B），梯度洗脱（0-18 min，5%A→16%A；18-20 min，16%A→24%A；20-41 min，24%A；41-43 min，24%A→85%A；43-48 min，85%A；48-50 min，85%A→5%A；50-60 min，5%A）;检测波长：203 nm 和 265 nm；柱温：40 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱适量，加甲醇适量溶解，配制成每1 mL含苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷 Re、盐酸小檗碱分别为 0．3、4．82、3．53、1．31、0．07 mg/mL 的对照品储备液，备用。

2.1.3 线性关系考察 取“2．1．2”配制的对照品储备液，用甲醇稀释成系列浓度，按“2．1．1”色谱条件测定色谱峰面积，以标准品浓度（μg/mL）为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱的线性方程分别为Y=20 653X-6 041．3（r=0．999 8），Y=3 762．5X+24 090（r=0．999 6），Y=3 735．8X+18 582（r=0．999 5），Y=2 140．7X+4 162．2（r=0．999 7），Y=45 027X-5 587．9（r=0．999 8），线性范围分别为 1．02～30．02 μg/mL、15．06～481．96 μg/mL、11．05～353．44 μg/mL、4．10～131．11 μg/mL、0．26～7．2 μg/mL。

2.1.4 精密度实验 取“2．1．2”配制的对照品储备液，用甲醇稀释成一定浓度，在“2．1．1”色谱条件下，连续进样6次，每次10 μL，测定色谱峰面积，得苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱的 RSD%（n=6）分别为 1．21%，1．44%，1．37%，1．14%，1．79%。

2.1.5 稳定性实验 取消糜栓1粒（3 g），制备溶出液，取 30 min 的溶出液 10 μL，于 0、2、4、8、12、24 h在“2．1．1”色谱条件下测定色谱峰面积，得苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱的RSD%（n=6） 分别为 1．90%、0．31%、0．40%、2．89%、2．85%。

2.1.6 回收率实验 称取3 g消糜栓空白基质，置于溶出杯中，加入200 mL超声脱气的蒸馏水，37℃水浴下加热，搅拌1 h，作为空白基质溶液。取“2．1．2”配制的对照品储备液，以空白基质溶液稀释，制成低、中、高3种不同浓度的混合供试品溶液（n=3）；同时用甲醇溶液稀释，配制相同浓度的混合对照品溶液（n=3）。按照“2．1．1”的色谱条件测定峰面积，计算低、中、高3个浓度的平均回收率（n=3），结果见表1。

2.2 溶出度检查法 采用流通池闭合系统装置，每次实验取消糜栓样品3粒，置于锥形部装满1 mm玻璃珠的流通池内，分别以水（超声脱气）和醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4．5）200 mL作为溶出介质，在流通池内以层流方式流动，温度设定为37℃。分别设定流速为 4、8 和 16 mL/min，于 15、30、45、60、75、90、105、120、150、180 和 240 min 取样 2 mL，滤过，按照“2．1．1”的色谱条件测定峰面积，应用外标一点法，在203 nm计算苦参碱、人参皂苷Re的溶出量（mg），在206 nm计算儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱的溶出量（mg）。

在8 mL/min流速下，考察两种不同溶出介质水、醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）对消糜栓中苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱的溶出度测定的影响，选取3个时间点：30、120、240 min的溶出量，利用SPSS 17统计软件进行两独立样本t检验比较分析。在两种介质中消糜栓的平均溶出量（mg）及t检验分析的显著性结果见表2所示。

表2 两种溶出介质中消糜栓5种成分溶出量及t检验显著性分析（±s）

表2 两种溶出介质中消糜栓5种成分溶出量及t检验显著性分析（±s）

成分 水中溶出量（mg）苦参碱 1.15±0.10 1.29±0.19 0.330 1.98±0.03 2.48±0.15 0.005 2.24±0.05 2.59±0.11 0.006儿茶素 49.19±2.56 48.03±3.35 0.658 79.19±2.01 83.42±4.13 0.185 88.84±1.18 86.50±2.12 0.171表儿茶素 7.85±0.51 7.63±0.67 0.675 13.07±0.37 13.78±0.63 0.167 13.59±1.09 13.83±0.76 0.774人参皂苷 Re 3.49±0.69 3.01±0.38 0.348 7.53±1.47 6.42±1.24 0.375 8.98±0.35 6.61±0.94 0.015盐酸小檗碱 0.46±0.06 0.43±0.07 0.594 1.03±0.07 0.82±0.07 0.016 1.05±0.06 0.88±0.06 0.006 n 3 3 3 3 3时间（min）30 120 240 30 120 240 30 120 240 30 120 240 30 120 240酸性介质中溶出量（mg） P

结果显示，两种溶出介质对于3个时间点下消糜栓中儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re的溶出无显著影响（P＞0.05），对于苦参碱、盐酸小檗碱在30 min无显著影响（P＞0.05），在 120 min、240 min 具有显著影响（P＜0.01）。

以水为介质时，在3种不同流速下，根据消糜栓样品中主要成分的溶出量（mg）绘制溶出曲线，结果如图1-5所示。

由图1-5的溶出曲线可知，消糜栓5种指标成分在流速为4、8和16 mL/min时溶出行为不同，在4、8 mL/min流速下溶出速率较慢；当流速为16 mL/min各成分的溶出速率最快。实验结果表明，流速对于消糜栓中苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱的溶出行为具有明显的影响，且流速越大，溶出速度越快。

图1 水为介质时不同流速下苦参碱的溶出曲线（n=3）

图2 水为介质时不同流速下儿茶素的溶出曲线（n=3）

图3 水为介质时不同流速下表儿茶素的溶出曲线（n=3）

图4 水为介质时不同流速下人参皂苷Re的溶出曲线（n=3）

图5 水为介质时不同流速下盐酸小檗碱的溶出曲线（n=3）

以水为溶出介质时，在不同流速下，选取3个时间点：30、120、240 min各成分的溶出量，利用SPSS 17统计软件进行单因素方差分析，结果见表3。结果显示流速的变化对于这3个时间点下苦参碱、儿茶素、表儿茶素3种成分有极显著影响（P＜0.01），对于人参皂苷Re和盐酸小檗碱，在30 min具有显著影响（P＜0.05），在 120 min及240 min无显著影响（P＞0.05）。

3 讨论

流通池法测定消糜栓溶出度条件的改变主要有改变流速、改变溶媒流动方式，改变溶出介质以及改变溶出介质体积等方面[14]。根据前期对于消糜栓传统溶出度测定方法的研究结果表明，桨法、篮法测定消糜栓溶出度时，人参皂苷Re、盐酸小檗碱在溶剂中的浓度较低，不利于测定，采用溶出介质体积较小的小杯法更能反映消糜栓各指标成分的溶出特性，且满足漏槽条件，在本实验中流通池法的溶出介质体积选用小杯法所用体积200 mL。

流通池法中溶媒的流动方式主要有层流和湍流两种[15-16]。层流方式是在流通池的锥形部放置1 mm的玻璃珠，从而使溶媒介质在流通池内均匀的流动，层流可以使被测样品均匀释放，不易产生突释；湍流方式即不加入玻璃珠，样品能够产生突释的效果，故此种流动方式一般适用于一些难溶性药物的溶出度测定。层流方式能够更加真实的模拟阴道环境，在本实验中采用层流方式。

本文选择苦参碱、儿茶素、表儿茶素、人参皂苷Re、盐酸小檗碱作为评价消糜栓溶出度的指标性成分能够客观真实的反应药物的溶出性能。实验结果表明盐酸小檗碱的溶出量较低，这可能是由于盐酸小檗碱是一种异喹啉类生物碱，其在水中的溶解度比较小[17]。本实验中，选择了 30、120、240 min 3 个时间段的溶出量进行统计学分析，主要是因为30 min的溶出量能够具有代表性的反映溶出开始时的溶出速率，120 min的溶出量则能够反映溶出趋于完全时的溶出情况；240 min时的溶出量则反映了药物整个溶出过程的最终溶出量。

表3 3种流速下消糜栓5种成分溶出量的单因素方差分析

实验结果表明，流速对于测定消糜栓5种成分的溶出具有显著的影响。流速是流通池法中一个及其重要的参数，故在每次实验过程中应当校正流速以获得良好的释放曲线从而评价其释放行为。本实验中选择的两种溶出介质水以及醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）对于苦参碱、盐酸小檗碱的溶出具有显著影响，对于其他3种成分不具有显著影响，这可能与消糜栓的处方组成、主要成分的化学结构、理化性质有关[18]。因此在流通池法测定药物的溶出度试验中，应当根据药物的处方特点、药理活性等选择具体的溶出介质。