生物支架材料在骨组织工程中的应用

李雪雯，刘尧，李波

（中国医科大学附属口腔医院 1.口腔解剖生理学教研室；2.儿童口腔科，沈阳 110002）

由颌面部肿瘤、先天畸形以及颌面部创伤导致的骨组织缺损是临床医疗过程中常见的问题，同时亦是颌面外科所面临的一个难题［1］。近年来，伴随骨组织工程的不断深入研究和发展应用，人工制备的生物材料逐渐成为了新型的骨组织替代物，为临床治疗骨组织相关疾病提供了一条新的思路［2］。随着分子生物学、细胞生物学、材料学以及工程学等相关学科的不断发展，兼具多种理化和生物性能的骨组织工程支架材料应运而生，这也为组织工程化骨的构建提供了宝贵基础和条件。骨组织工程的核心在于建立包括种子细胞在内的具有生物活性的三维结构复合体，即构建出具有生物活性和功能的组织，用以重塑病损组织的形态、恢复其结构与功能，同时对已有的缺损组织进行永久替代。骨组织工程原理的研究应用拓宽了以往对于骨相关疾病诊疗方法的认知范围［3］。本研究对生物支架材料在骨组织工程中的应用进展进行综述。

1 天然支架材料在骨组织工程中的应用

1.1 胶原

胶原是由多种类型的糖蛋白构成，约占机体内总蛋白含量的30%［4］，其中约85%为Ⅰ型胶原。胶原作为来自于生物体内的天然高分子材料具有较为良好的生物相容性，降解性良好且能够进行调节，因而Ⅰ型胶原作为承载细胞的支架材料有利于促进细胞黏附、生长和分化，能够较好地发挥引导组织再生的作用［5］。ZHOU等［6］通过细胞增殖实验对接种于胶原/羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）复合纤维上的细胞进行了监测，结果显示该复合纤维不仅对细胞无体外细胞毒性，并且能够促进其黏附及增殖。

目前，应用于骨组织工程的胶原支架类型主要包括呈现多孔状的胶原海绵与表现为半固态性质的胶原凝胶。其中，胶原海绵已经作为医用止血制品在临床方面得到了广泛的应用；多孔状的胶原海绵既有较好的生物安全性，又可以保持较高的孔隙率，能够作为骨组织工程支架材料的来源。目前，多孔胶原海绵作为三维空间支架材料应用于多种细胞（人成纤维细胞、成骨细胞以及骨髓细胞等［7］）的培养。胶原凝胶表现为半固态、半液态，具有一定的可流动和可塑特性。对于美容整形外科来说，商品化的胶原凝胶可作为一种软组织的填充替代物，已有研究［8］将胶原凝胶作为支架材料，成功对腔隙性的骨组织缺损进行了修复重建。

1.2 丝素蛋白（silk fibroin，SF）

蚕丝是一种天然纤维，由内层的丝素和外层的丝胶构成，SF属于蚕丝的重要组成成分。作为一种无不良反应的天然生物材料，SF具有良好的生物相容性和降解性［9］，不会引起机体免疫应答，并且能够促进黏附的多种细胞生长、增殖。同时，SF具备良好的物理化学性质和机械性能，经力学牵拉检测发现SF具备良好的机械力学性能，能够承载较强的拉力［10］，因而将SF作为支架材料应用于骨组织工程［11］。

SAHU等［12］将成骨细胞与SF进行复合培养，发现SF可于体外诱导骨组织生成，说明SF可以成为类骨组织的基质材料。已有研究［13］将人间充质干细胞接种至多孔SF支架材料上，于体外成骨培养基内复合培养8周，然后将细胞支架复合体植入小鼠体内，结果显示存在临界骨缺损的部位形成了以桥接形式连接的新骨。目前，兼备良好生物相容性和可降解性的SF可以加工成膜、凝胶、支架等多种形式，在骨组织工程领域得到了广泛应用［14］。

1.3 壳聚糖（chitosan，CS）

CS是迄今为止自然界唯一带正电的天然碱性多糖，具备生物降解性可控、组织相容性优良、安全无不良反应、无免疫原性且能抗细菌和真菌的特性，是具有广泛应用前景的组织工程天然高分子聚合物［15-17］。

EZODDINI-ARDAKANI等［18］建立了大鼠胫骨骨缺损模型，将CS粉末植入实验组大鼠右侧胫骨骨缺损的部位，结果表明CS对大鼠胫骨的骨再生存在明显的促进作用，同时进一步证明了CS兼备良好的生物相容性以及骨诱导性。CS能够制备形成各种性状，目前常用的制备方法为真空冷冻干燥法，经由真空冻干消除冰晶并形成多孔结构，通常认为将支架的孔径范围控制在100～150 μm更利于细胞的黏附生长和血管的形成［19］。

为了使支架材料具备可注射性，已制备出可注射的CS水凝胶，CS水凝胶能够作为活细胞的载体并保持其活性。闫继红等［20］制备了CS/β-甘油磷酸钠温敏凝胶，观察发现凝胶体系在常温状态下为流动性液体，当温度升至37 ℃时能够凝固成胶；将凝胶与骨髓间充质干细胞复合培养，结果显示接种于凝胶上的细胞生长情况良好，进一步表明CS/β-甘油磷酸钠凝胶具备良好的生物相容性，有利于细胞生长，可作为组织工程支架材料。

2 人工合成支架材料在骨组织工程中的应用

2.1 无机材料

HA是骨盐的主要组分，也是牙齿的重要无机矿物质。在组织工程中，HA有着较为良好的骨传导性与化学稳定性，可以为种子细胞提供进行成骨分化的微环境。同时，以人工方法合成的HA具备了和人体自然骨中无机成分相类似的化学成分与结构，因而在生物医疗方面可以将人工合成的HA用作骨组织的替代物。与其他类型的人工合成材料比较，HA兼具优良的生物安全性、生物活性以及能够与机体组织发生键合羟基基团，植入机体内安全且无不良反应，对机体组织具有亲和性、不引起免疫排斥反应。此外，HA的构成成分当中包含钙和磷元素，可以参与机体的正常新陈代谢过程。然而，以HA构建而成的人工骨虽具备良好的骨传导性能，但却不具有骨诱导的特性，因此在应用方面受到一定程度制约。

近些年，伴随组织工程研究的不断深入，为了能够使植入缺损部位的替代物兼具骨诱导性和成骨性能，研究［21］显示将具备骨诱导性或成骨作用的材料与HA结合，可制备形成既拥有骨传导性能，又具备骨诱导性或者成骨作用的复合型支架材料。

2.2 有机高分子材料

近年来，随着人工可降解高分子聚合材料的不断发展，聚乳酸类高分子聚合物在医学方面［手术缝合线、药物缓（控）释体系等］广泛应用，已经成为当前应用范围最广的组织工程支架材料之一［22］。目前常用的人工高分子聚合物种类较多，其中以聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）以及二者共聚体［poly（D，L-lactic-co-glycolic）acid，PLGA］应用最广［23］。在组织工程中，已经采用了多种方法（热致相分离、发泡以及静电纺丝等［24-25］）对聚乳酸类生物材料进行制备。制备完成的PLA、PGA以及PLGA主要应用形式有多孔纤维支架、泡沫结构与管状结构等，这些形式材料在骨组织工程应用均呈现出了较好的诱导成骨效应［26］。

PLA与PGA已作为骨、软骨、肌腱和心脏瓣膜等各类组织工程细胞外支架材料广泛应用，并已初步获得成功。LI等［27］报道将小鼠坐骨神经细胞接种于PLGA/明胶支架上进行复合培养，实验结果表明坐骨神经细胞可以在支架上很好黏附、生长。HU等［28］在改良式PLGA支架材料上接种小鼠血管平滑肌细胞进行共培养，于第2、4、7天分别对细胞进行MTT检测，结果显示复合于支架上的细胞生存状况良好且增殖速率未受影响。目前，尽管PLA、PGA与PLGA作为支架材料在组织工程应用方面较为广泛，却仍然存在不可忽视的缺点，包括（1）亲水性较差、对细胞的吸附能力不强；（2）容易引发机体出现无菌性炎症；（3）机械力学性能不足以及制备共聚物过程中残余的有机溶剂对细胞和周围组织的毒性作用等。

3 复合支架材料在骨组织工程中的应用

单一类型材料（天然高分子材料、人工高分子聚合物等）虽各具优势，但作为支架材料仍难以满足骨组织工程的全部要求。例如，天然高分子聚合材料尽管具备优良的生物相容性和降解性，但是仍存在机械性能不强，骨诱导能力不佳等问题，如若将其作为骨组织工程支架材料单独使用则修复效果会受到影响。针对天然高分子材料面临的这些问题，可以通过物理、化学混合或改性的方式来提高其力学和生物学特性。此外，将人工高分子聚合材料与生物陶瓷类材料相复合能够使人工高分子物的机械性能加强，并能够对其在降解后产生的酸性物质进行中和，进一步提高支架的骨结合能力与组织相容性。

HUNTER等［29］报道将骨髓基质细胞与HA/CS/明胶支架复合后可诱导细胞向成骨分化，说明材料中的3类成分存在协同促成骨的作用。HA的机械性能不佳，无法用于进行高强度受力部位的骨组织再生，因而可利用多糖类材料对HA的机械强度（压缩强度、压缩模量等）进行改性。FROHBERGH等［30］以京尼平作为交联剂制备了静电纺丝HA/CS支架，发现交联后的支架材料表面的HA分布均匀，性质稳定，且复合于支架内的细胞其成骨分化能力得到了明显提高。

碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）具备较强的压缩模量和拉伸强度，并且有良好结构稳定性和生物活性，因此，这些优点使CNTs成为了极具发展前景的应用型材料。USUI等［31］首次报道合成了CNTs，并指出其具备良好的骨组织相容性，当CNTs负载骨形态发生蛋白后可以刺激、加速骨形成，促进骨的修复与整合。ARYAEI等［32］将CNTs加入CS中，分别制备浓度为0.1%、0.5%和1%的CNTs/CS复合膜，发现复合材料在拉伸强度、弹性模量等性能方面出现了大幅度提高，因此复合CNTs可使CS的拉伸性能、弹性模量等机械特性明显提升。

ARIANI等［33］利用冻干技术制成具备三维连接多孔结构的碳酸磷灰石/CS支架，并通过实验证明了该支架能够促进成骨细胞的增殖、分化。将钙磷酸盐与CS进行复合制备而成的脱乙酰聚糖/磷酸钙支架具备更佳的生物学性能，通过机械力学检测结果提示该支架具有与人骨小梁相似的抗压强度，并且将支架与MG63细胞体外复合培养，结果显示细胞在支架上的黏附、增殖、分化情况均良好［34］。FLORCZYK等［35］以CS/藻酸盐支架植入至SD大鼠骨缺损区域内，并分别于植入后第4、16周进行对缺损处进行micro-CT检测，通过组织学结果分析表明，利用负载骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）的支架处理的SD大鼠在第16周的新骨形成率达70%左右。

4 总结与展望

用于组织工程的支架材料在形状上需要对复杂的缺损区域进行完全充填；在机械性能方面能够在组织修复完成之前暂时替代缺损处的组织；支架材料在生物相容性方面应该具备一定的生物活性，为细胞提供适宜的黏附增殖环境并诱导组织再生［36］；此外，支架还应具备可植入性，能够通过手术方式植入体内并固定于缺损部位，从而达到预期修复目标。虽然现阶段关于骨组织工程支架的相关研究较多，然而至今为止仍未能找到或构建出一种完全与组织工程支架标准相符合的材料。

口腔颌面部骨组织不同于机体其他部位的规则骨，其在解剖形态与生理功能方面均存在一定的特殊性。因而，传统的组织工程支架制备方法（冻干法、静电纺丝等）难以制备出在结构上具有个性化体现、完全适用于颌面部骨的组织工程支架。3D打印模式为解决这一问题指出了新的思路。3D打印技术（快速成型技术）是一种以计算机辅助设计（computer aided design，CAD）数据为基础，经由快速成型机，通过分层加工和迭加成型的方法，由快速成型机逐层添加材料，从而制备形成材料的3D实体。常用作制备骨组织工程支架的3D打印技术包括熔融沉积成型法（fused deposition molding，FDM）、选择区域激光烧结法（selective laser sintering，SLS）、立体光固化印刷法（stereo lithography appearance，SLA）以及3D生物打印法（3D bioprinting，3DP）［37-38］。目前，已有研究将3D打印技术与骨组织工程技术结合，针对口腔颌面部的颌骨及牙槽骨缺损进行修复并取得较好效果［39］。

近年来，伴随材料学、工程学以及生命科学的不断进步，研究人员也逐步意识到单一使用某种材料具有局限性和缺陷性，由此复合型支架材料得以不断发展。但是，复合型材料虽然在性能方面有所提升，其在临床应用等方面仍存在一些问题。例如，将骨替代物植入缺损部位后，如何控制复合材料的降解速度，使其与组织细胞生长以及新骨形成的速率匹配和适应；如何调整材料内部各组分的比例，使复合支架材料具备较高机械力学强度的同时兼具较好的孔隙率和孔径。这些问题不仅决定了支架材料的理化和生物学性能，同时还影响骨组织工程产品发挥其应有的效果。因此，能否成功获得具有理想性能的支架材料，对于骨组织工程的应用范围及效果具有重要意义。