40株耐多药结核分枝杆菌临床分离株对利奈唑胺及特地唑胺药物敏感性的研究

罗明 张汇征 严晓峰 陈耀凯 黄正谷 周刊 李同心 李俊刚 王静 廖传玉

耐多药结核病(MDR-TB)的治疗疗程长，费用高，治愈率仅为55%左右，而广泛耐药结核病(XDR-TB)的治愈率更是低至34%[1]。恶唑烷酮类药物是一类全新合成的抗菌药物，利奈唑胺(Lzd)作为第一种上市的恶唑烷酮类抗生素，已被WHO列为治疗MDR-TB的A组药物[2-3]。特地唑胺(Tzd)作为第二代恶唑烷酮类药物，虽已有研究表明其不仅对革兰阳性菌(包括分枝杆菌)表现出了很好的抗菌活性，而且对Lzd敏感性降低的病原菌仍有很好的效果[4]，但目前尚未用于结核病的治疗。笔者通过检测40株MDR-MTB临床分离株对Lzd和Tzd的敏感性，以初步了解MDR-MTB菌株对这两种药物的敏感性差异，为今后将Tzd用于结核病的临床治疗提供实验室数据支持。

材料和方法

1.菌株来源及菌种鉴定：采用简单随机抽样法中的直接抽选法从重庆市公共卫生医疗救治中心中心实验室2018年1—12月间培养分离并经药物敏感性试验(简称“药敏试验”)鉴定为MDR-MTB的菌株中选取40株。结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)标准菌株由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

2.试剂和仪器：中性罗氏培养基和结核分枝杆菌药敏检测试剂盒(比例法)由珠海银科医学工程有限公司生产。Lzd、Tzd原药药粉由美国MCE公司生产。7H9肉汤培养基、油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(OADC)增菌液购自美国BD公司。吐温80及二甲基亚砜(DMSO)均购自美国 Sigma 公司。

3.比例法药敏试验：参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]，对分枝杆菌阳性培养物进行利福平(R，40 μg/ml)、异烟肼(H，0.2 μg/ml)、阿米卡星(Am，30 μg/ml)、卷曲霉素(Cm，40 μg/ml)、左氧氟沙星(Lfx，2 μg/ml)等抗结核药物的药敏试验，耐药判定标准参照文献[5-6]。

4.最小抑菌浓度(MIC)法药敏检测：采用MIC检测耐多药结核分枝杆菌(MDR-MTB)临床分离株对Lzd和Tzd的敏感性。按照文献[5]操作，药物浓度均倍比稀释设置为0.030～16.000 mg/L的10个梯度[5]。刮取罗氏培养基上处于生长对数期的培养物，经研磨分散重悬后，用7H9培养基配成1个麦氏浓度溶液，按1∶10稀释至含10%OADC的7H9培养基中。在制备好的药敏平板每孔加入稀释后的菌液100 μl，37 ℃恒温培养7 d。每孔加入20 μl刃天青显色液，再在37 ℃培养24 h后观察显色读取MIC，完全没有变色的最小药物浓度即为该菌株对这种药物的MIC[5, 7]。

5. 统计学处理：采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料为偏态分布，以“中位数(四分位数)”表示；计数资料以“率(%)”表示；Lzd与Tzd对菌株MIC之间差异的比较采用Wilcoxon配对设计符号秩和检验，Lzd和Tzd对不同耐药类型菌株MIC间差异的比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Lzd和Tzd对MDR-MTB的MIC检测结果： Lzd对MDR-MTB的MIC范围在0.250～2.000 mg/L，中位数(四分位数)为0.500(0.500，1.000) mg/L，其中87.5%(35/40)的菌株MIC处于0.500～1.000 mg/L；Tzd对MDR-MTB的MIC范围在0.060～1.000 mg/L，中位数(四分位数)为0.250(0.250，0.250) mg/L，其中87.5%(35/40)的菌株MIC处于0.125～0.250 mg/L。Lzd对MDR-MTB的MIC50和MIC90分别为0.500、1.000 mg/L；Tzd对MDR-MTB的MIC50和MIC90均为0.250 mg/L。Tzd的MIC明显小于Lzd的MIC，差异有统计学意义(Z=-5.51，P<0.001)。97.5%(39/40)的菌株Lzd的MIC大于Tzd的MIC，仅1株菌对2种药物的MIC相同，均为1.000 mg/L。1株菌对Lzd耐药(MIC=2.000 mg/L)，其Tzd的MIC为0.500 mg/L。

2.Lzd和Tzd与其他药物的交叉耐药性：参照比例法药敏试验结果，40株MDR-MTB临床分离株按对Lfx、Am和Cm的不同耐药谱可分为13株MDR-MTB，20株前广泛耐药结核(pre-XDR-MTB)和7株XDR-MTB。Lzd对MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB的MIC的中位数(四分位数)均为0.500(0.500，1.000) mg/L。Tzd对MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB的MIC的中位数(四分位数)均为0.250(0.250，0.250) mg/L。Lzd和Tzd对不同耐药类型菌株的MIC差异均无统计学意义(Lzd：H=0.84，P=0.659；Tzd：H=0.59，P=0.746)。

讨 论

MDR-TB的出现和传播，极大地阻碍了全世界控制结核病的进程。中国是结核病和耐药结核病的双重高负担国家之一，WHO[1]估算在2017年我国约有88.9万例新发结核病患者，其中有5.8万例为MDR-TB或耐利福平结核病(rifampin-resistant tuberculosis，RR-TB)。由于新的抗结核药物的缺乏，使得MDR-TB的治疗极为困难，而发掘现有药物的抗结核活性并用于临床成为一条便捷的途径。

恶唑烷酮是一类人工合成的抗生素，表现出很好的抗分枝杆菌活性，其作用机制为与核糖体50S亚基结合，阻止了70S起始复合物的形成，从而在翻译的早期阶段抑制了细菌蛋白质的合成[3]。

在本研究中，通过MIC法检测Lzd和Tzd的抗结核活性，两种药物均表现出了很好的效果。在40株MDR-MTB中，仅有1株菌对Lzd耐药，Tzd对所有菌株的MIC均低于美国临床标准化实验室协会(CLSI)推荐的Lzd耐药折点(>1 mg/L)[8]。Lzd对MDR-MTB临床分离株的MIC多处于0.500～1.000 mg/L，略高于其他研究报道的 0.250～0.500 mg/L的结果[9-11]；Tzd对MDR-MTB临床分离株的MIC多处于0.125～0.250 mg/L，与廖传玉等[12]及Ruiz等[13]的研究结果一致。这种不同表现是否由于流行菌株谱系差异所造成，尚需进一步研究。

在本研究中，Lzd对MDR-MTB的MIC50和MIC90分别为0.500、1.000 mg/L；Tzd对MDR-MTB的MIC50和MIC90均为0.250 mg/L，提示Tzd相比Lzd具有更好的抗结核效果，与Ruiz等[13]研究结果一致。结果也显示，即使是对Lzd耐药的1株菌株，其Tzd的MIC仍小于Lzd的1 mg/L的耐药折点，说明即使是对Lzd耐药的菌株，对Tzd仍可能是敏感的，这与Ruiz等[13]研究结果一致。同时我们也注意到，有一株菌株两种药物的MIC相同，提示对于部分菌株来说，Tzd的效果并不一定好于Lzd。本研究还显示，Lzd和Tzd对MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB的MIC没有差异，这与文献[12-14]研究结果一致，提示目前恶唑烷酮类药物敏感性与其他药物无关，在制定MDR-TB治疗方案时，其他药物的药敏结果对恶唑烷酮类药物的选用不具有参考价值。

本研究存在一定局限，即纳入的样本量较小且为非多中心研究。但本次研究结果初步明确了Lzd和Tzd两种恶唑烷酮类药物对MDR-MTB的MIC分布。结果表明，Lzd和Tzd对MDR-MTB菌株均有较好的杀菌效果，Tzd具有较Lzd更好的抗结核效果，而且对Lzd耐药的菌株对Tzd仍可能是敏感的。Tzd已展现出了作为抗结核药物的良好潜力，下一步仍需要多中心、大样本的临床研究，以进一步明确其对耐药结核病的有效性。