子宫颈癌细胞学新型生物标志、诊断标志物的筛选和开发现状

李红芳 赵小环 王丽萍 许晓燕 孙高高

从子宫颈癌的早期诊断方法子宫颈脱落细胞巴氏涂片技术，到目前广泛应用于临床的子宫颈液基薄层细胞技术（thinprep cytologic test，TCT），都主要是评估子宫颈上皮细胞核的形态，其结果在不同研究中敏感性差异较大（33.8%～94.0%）。因此，有必要开发更可靠的，包括新型生物标志、诊断标志物在内的替代诊断试验方法[1]。

一、新的子宫颈癌相关蛋白生物标志物和诊断靶标的发现

蛋白质组学已经成为一种有力的工具，揭示了病毒感染与蛋白质变化之间的联系。在子宫颈癌相关细胞系和组织样品中已经使用了多种基于凝胶的二维凝胶电泳（twodimensional gel electrophoresis，2DE）和无凝胶方法液相色谱-质谱法（liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS）。将蛋白质组学数据与其他“OMICS”数据（如基因组学和转录组学等）相结合，已经确立了其在系统生物学的作用[2]。个性化治疗子宫颈癌的药物可以通过肿瘤的分子鉴定来完成，这将促进靶向治疗的选择。目前子宫颈癌蛋白质组学研究为发现早期诊断子宫颈癌生物标记物提供了良好的方法和靶标[3]，并为阐明最终导致子宫颈癌发生的人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染的分子途径提供了可靠手段。蛋白质组学被用来研究子宫颈癌基因治疗药物的作用，进而在分子水平上解释其作用模式[4]。

子宫颈癌主要由HPV引起，且HPV16和HPV18为最常见的亚型。HPV颗粒含有一个由8个基因组成的8 000 bp的双链闭环DNA[5-6]。乳头状瘤病毒（papillomaviruses，PVs）属于无包膜的病毒组，可引起良性病变，称为黏膜上的非生殖器皮肤疣和肛门生殖器疣（尖锐湿疣）。PVs也是导致上皮恶性肿瘤的原因，其可导致子宫颈癌和泌尿生殖道的其他肿瘤。HPV具有感染黏膜如口腔黏膜和子宫颈黏膜的潜能，导致的临床结果具有多样性，由于它们会被免疫系统清除导致无症状、自我限制或恶性转化[7-8]。虽然诊断工具广泛应用，但全世界子宫颈癌发病率仍然居高不下，特别是在发展中国家，这主要归因于TCT敏感性不理想[9-10]。蛋白质组学方法已被用于研究HPV与子宫颈癌病理的相关性，以及研究早期子宫颈癌诊断和药物作用模式的假定生物标志物。基于序列相似性，根据国际病毒分类委员会制定的标准对HPV进行分类。根据从人类组织中分离和鉴定基因组的分类，截至2013年的分类共包括170个测序的HPV类型。HPV可通过表皮上的轻微磨损而感染子宫颈上皮的基底层，一旦侵入，它会经历以下几个阶段。在扩增阶段，HPV在受感染的细胞中作为50～100个拷贝的增殖速度导致低级别鳞状上皮内病变（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）。在维持阶段，病毒被整合到宿主基因组中并逐渐发展为高级别鳞状上皮内病变（high grade squamous intraepithelial lesion，LSIL），甚至子宫颈浸润癌。最后是复制或扩增阶段，HPV在分化细胞中高拷贝数的病毒DNA扩增导致其在病毒衣壳中的包装。在子宫颈癌中，病毒DNA的整合导致E6和E7蛋白过度表达，并伴随着E1、E2、E4、E5以及L1、L2衣壳蛋白表达的丧失[11]。

研究者对子宫颈癌蛋白质组学有很大的兴趣，主要是由于其可以高效发现诊断以及预后生物标志物。发现新型生物标记物的第一步主要是利用已建立的体外系统研究差异表达的蛋白质[12]。由于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16INK4a在异常增生上皮中高表达，p16INK4a蛋白已被提议用于早期诊断子宫颈癌。p16INK4a和细胞增殖标志物Ki-67的双染色细胞学可提高诊断的灵敏度[13-15]。然而，由于没有用于免疫组织化学和细胞学的统一评分系统等局限性妨碍了这些生物标志物在子宫颈癌筛查中的联合应用。在相同的情况下，已经提出了一些额外的标志物用于子宫颈癌的早期检测，例如作为E5 HPV蛋白质的靶标的表皮生长因子受体、细胞周期蛋白依赖性激酶的p21和p27抑制剂、环氧化酶-2、血管内皮生长因子和小窝蛋白-1等。HPV癌蛋白的分子靶点是与HPV癌蛋白（如E5，E6和E7）相互作用的蛋白质，主要在癌发生的早期阶段相互作用，并且其可能是潜在的用于临床的生物标志物[16-18]。其他推测的标志物是ProEx C免疫细胞化学测定靶向拓扑异构酶Ⅱ蛋白和微染色体维持复合物Ⅱ蛋白的表达以及受E5、E6和E7 HPV蛋白质调节的微小RNA的水平[19-23]。Lin等[24-25]报道了罕见和高度侵袭性子宫颈癌（神经内分泌子宫颈癌）的假定诊断和预后生物标志物，联合使用二维差异凝胶电泳（two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）以期揭示神经内分泌和非神经内分泌子宫颈癌之间在蛋白质组水平上的差异，从而鉴定潜在的神经内分泌生物标志物。将神经内分泌起源的子宫颈细胞癌系HM-1与非神经内分泌起源的细胞系CaSki、ME-180和Hela进行比较，鉴定发现了82个差异表达的蛋白质。与非神经内分泌起源的细胞相比，转凝蛋白（transgelin）和半乳糖凝集素1（galectin-1）在HM-1细胞中表达上调，而stath和磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）表达下调，蛋白质印迹法进一步验证了transgelin和galectin-1这一发现[26-30]。

诊断、预后和预测性生物标志物的评估已应用于临床，目前报道的多项研究已经通过多种蛋白质组学方法检测了生物样品的潜在生物标志物，如组织、血浆/血清、细胞活组织检查 /子宫颈拭子、来自细胞活组织检查的残余液体、细胞粘液和子宫颈阴道液体（CVF）。在最近的一项研究中，通过2D-DIGE法分析来自正常子宫颈、子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期）和子宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）（Ⅰb和Ⅱa期）的组织样本，鉴定了26个有统计学显著差异表达的蛋白质。通过蛋白质印迹和免疫组化进一步验证，S100A9、eEF1A1、丙酮酸激酶2（pyruvate kinase M2，PKM2）被推荐为诊断性生物标志物[31]。在另一项研究中，通过激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）和2D-DIGE蛋白质组学分析正常子宫颈上皮组织、高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）和子宫颈癌组织，鉴定了23个有统计学显著差异表达的蛋白质[32-35]。从上述定量差异中，通过免疫组化进一步分析cornulin、PA28β、热休克蛋白（heat shock protein，HSP）B1和MnSOD，发现cornulin是最重要的假定生物标志物。作者对文献进行了批判性回顾，以根据HPV直接或间接相互作用、潜伏期中的生长选择或病变微环境中的相互作用对潜在标记物进行分类[36-38]。2DE结合LC-MS/MS被用来鉴定人类CSCC组织和正常组织之间差异表达的蛋白质，鉴定出5个有统计学意义的差异表达蛋白质，并通过蛋白质印迹法在临床样品和代表性子宫颈癌细胞系中进一步验证，HSP70、HSP27和转基因蛋白-2表达上调。

在一项研究中，其中通过2DE分析CSCC和鳞状细胞阴道癌（SVC）的组织蛋白质组以及与其对应的正常粘膜对照，以鉴定子宫颈癌假定生物标志物的组织特异性，比较鉴定了99个有统计学显著差异表达的蛋白质用于CSCC的特异性区分[39]。通过2D/MALDI-TOF-MS法将子宫颈癌组织与正常组织进行比较，鉴定了30个有显著统计学差异表达的蛋白质，其中HSP60在肿瘤组织中表达上调，并且通过蛋白质印迹进一步验证了这一观察结果。然而，HSP60 mRNA水平在肿瘤和对照之间没有显著差异，表明HSP60的转录后调节参与了子宫颈癌的进展，HSP60也被提议作为预后指标[40]。

通过LCM结合多维色谱和串联质谱分析子宫颈癌进展的代表性组织，对差异表达的蛋白质进行定量并基于基因本体分析，选择角蛋白4和角蛋白17用于进一步验证。从正常组织向肿瘤阶段逐渐发展的过程中，这些蛋白质呈现出的趋势不同，角蛋白17从正常到LSIL、HSIL再到肿瘤阶段中表达增加，而角蛋白4在这一过程中表达降低。角蛋白17表达水平和CSCC患者的Kaplan-Meier生存曲线揭示了角蛋白17高表达与患者低存活率的强相关性，增加了该蛋白质在评估CSCC预后上的价值。此研究进一步将蛋白质组学结果与临床数据联系起来，为角蛋白17在子宫颈癌中的作用提供了充分的证据[41]。Wang等[42]考虑盆腔淋巴结转移（pelvic lymph node metastasis，PLNM）对子宫颈癌的治疗和预后有重要意义，通过2D-DIGE/MALDI-TOFMS法将有PLNM与无盆腔淋巴结转移（NPLNM）患者的子宫颈组织进行比较，鉴定了41个有差异表达的蛋白质。与NPLNM组相比，FABP5、HSPB1和MnSOD在PLNM组中表达上调，并通过蛋白质印迹和免疫组化进行了验证。对上述蛋白质的Kaplan-Meier存活图进行分析，结果表明特定蛋白的高表达水平与生存率低存在较强相关性，以此可鉴定可靠的生物标志物。Yu等[43]通过2D/MALDI-TOFMS分析人CSCC和邻近的正常子宫颈组织，报道了55个差异表达的的位点。蛋白激酶C（protein kinaseC，PKC）在肿瘤组中与正常组相比表达上调，并且通过蛋白质印迹和免疫组化分析验证。通过2DE对感染高危HPV 16或18型的子宫颈癌组织与Hela细胞系进行比较，差异表达的蛋白质在细胞核和细胞质部分被鉴定（分别为30和28）。根据替代终点生物标记如增殖标记、亚细胞定位的调控标记、细胞周期和遗传不稳定标记，将蛋白进一步分类，没有进一步验证上述蛋白质组学的发现。将来自子宫颈上皮的正常组织，而不是源自前皮层的Hela细胞系，可以更准确地进行含有HPV 16或18型的临床样品的比较。由于通过腹部手术获得的正常子宫颈组织非常少见，所以子宫颈细胞系可能是另一种选择，如HCK1T细胞[44]。学者通过2DE分析人类CSCC和其相邻的正常组织，发现55个蛋白质表达具有统计学意义，其中Tyk2、S100A9和ZNF217在肿瘤组中的表达上调，并且通过蛋白质印迹进一步验证，表明其在诊断和治疗中可能起作用[45-46]。目前认为，在相同情况下，通过2D/ MALDI-TOF-MS将CSCC组织与正常组织进行比较发现 7种蛋白质（AIF-1、ALP2、B-FABP、NCK-1、ICA69、PRSS1和CDK4）在肿瘤组中表达上调，并在mRNA水平得到验证。B-FABP、NCK-1和CDK4的差异表达也经蛋白质印迹和免疫组化证实，可作为可能的子宫颈肿瘤标志物[47]。在一项类似的研究中，通过2D/MALDI-TOF-MS将CSCC组织与正常组织进行比较，鉴定了35个表达有统计学意义的蛋白质。14-3-3ε、膜联蛋白A1和鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）-2是最显著的发现，后两个进一步通过蛋白质印迹法得到验证[48-49]。

在对患者血浆/血清的研究中，蛋白组学同样有重要发现。通过2D/MALDI-TOF-MS分析来自对照组、CIN Ⅲ和CSCC Ⅳ期患者的血浆样品，得到了18个表达有统计学意义的蛋白质。细胞角蛋白19和四连蛋白通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）得到验证。虽然细胞角蛋白19不是一种真正的分泌蛋白，但它可以在肿瘤中经蛋白水解后在血流中释放[50]。使用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）和阳离子交换蛋白芯片分析早期子宫颈癌（原位癌），有淋巴结转移的浸润性子宫颈癌和对照组的血浆样本，鉴定每个组的特异性峰模式，从而阐明原位癌和侵袭性癌之间的差异蛋白质组谱[51]。然而，没有确定特征峰限制了该研究。为比较CSCC患者和慢性子宫颈炎患者的血浆的蛋白质组，使用了一种替代方法。通过生物反应路径生物信息学工具鉴定和分析了16个表达有统计学意义的蛋白质，由于其与肿瘤的生物学相关性，APOA1、APOE、CP、CLU、FBLN1、MASP2、TTR被重点关注。其中APOA1，APOE和CLU的水平通过ELISA测定，并且发现与慢性子宫颈炎相比，LSIL、HSIL和子宫颈癌中的水平显著不同，使其成为可能的血浆生物标志物。通过将来自子宫颈癌患者的血清样品与来自健康供者的血清进行比较，得出了3个有统计学意义的峰值。第1个是对应于纤维蛋白原α-E链内部片段的5 906 Da的上调蛋白质，另2个4 175、3 974 Da的峰被认为是可能的生物标志物，但无法确定[52]。另一项研究中，通过2D-DIGE/LC-MS分析对照，CIN Ⅲ患者、CSCC早期（CSCCⅠ和Ⅱ）和CSCC晚期（CSCC Ⅲ和Ⅳ）患者的血清样品，在152份样本中通过ELISA验证补体因子H、CD5样抗原、凝溶胶蛋白和铜蓝蛋白，并将20个表达有统计学意义的蛋白质掺入生物网络中，其中凝溶胶蛋白和血浆铜蓝蛋白与癌基因核因子（nuclear factor，NF）κB相互作用。通过免疫组化检测上述蛋白质的表达，发现在微浸润和癌变病灶中的染色强度较高，表明它们是LSIL进展为子宫颈癌的预测性生物标志物[53]。使用超灵敏的高性能LC-激光诱导的基于荧光的蛋白质组学方法来分析从子宫颈癌患者和健康对照组的脱落细胞样本及血清的蛋白质表达谱。通过数据分析区分每种情况下的蛋白质组峰分布，对肿瘤、癌前期和健康阶段准确分类，使得该方法成为可能的诊断工具。即使没有确定峰，作者声称蛋白质谱可视化在早期鉴别正常组织与恶性肿瘤阶段组织是有效的[54]。另一组使用相对和绝对定量的等压标签（iTRAQ）和靶向质谱定量联合分析来自CIN、早期（CES）和晚期（CLS）子宫颈癌患者的血清，分析鉴定了6种差异表达的蛋白质（α-1-酸性糖蛋白1、α-1-抗胰蛋白酶、血清转铁蛋白、触珠蛋白、α-2-HS-糖蛋白和维生素D结合蛋白）。在由对照组、CLS和卵巢癌组成的独立组的229个血清样本中通过多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）验证了6个可以从健康对照中区分CIN患者的蛋白质组，灵敏度为67%，特异性为88%。与SCCA（一种被广泛研究的假定的子宫颈癌生物标记物）的特异性结合，改善了对健康对照组的CIN、CES和CLS患者的区分。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析显示，仅使用SSCA时、使用6个蛋白质组时以及两种方法联合使用时进行CIN与健康组的比较，发现曲线下面积（area under curve，AUC）依次递增。作者指出，到目前为止，任何基于血液的诊断测试尚未达到以上的鉴别水平。在分别使用SSCA或6个蛋白质组进行CES与健康组之间的鉴别中，AUC=0.72，而在联合使用6个蛋白质组和SCCA进行同一鉴别时，AUC提高到0.86，该研究实现了临床上CIN、CES或CLS与对照组的有效区分[55]。

研究者也对子宫颈活检和子宫颈拭子来源的临床标本进行了蛋白组学分析。使用来自子宫颈拭子的临床样本比较基因组和蛋白质水平上的不同分布。特别地将拭子置于称为RNAlater的含水RNA保存剂中，其在溶解细胞粘液后允许蛋白质沉淀。肿瘤组与正常对照相比，通过2D-DIGE/ MALDI-TOF-MS鉴定了390个差异表达的位点。将cDNA微阵列数据与蛋白质组学数据结合。HNRPA2B1在子宫颈拭子中通过蛋白质印迹进行验证，被认为是子宫颈癌的候选生物标志物[56]。

新近的研究也报道了CVF和子宫颈活检残留液体的蛋白组学研究成果。CVF是一种容易获得的液体，含有丰富的假定生物标志物，可用于基于自我检测的诊断。收集来自健康和CIN的CVF临床样本，并使用MALDI-TOF-MS联合高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。两组之间鉴定出12个表达有统计学意义的蛋白质。选择α-actinin-4用于CVF中的ELISA进一步验证，显示从正常向低危型HPV阳性样本和高危型HPV阳性样本的进展中，表达进一步增高。更有意思的是，在9例患者的纵向样品中也进行了ELISA检测，证实α-actinin-4是判断健康和癌前病变阶段的假定生物标记物[57-58]。Boylan等[59]使用另一种方法来研究巴氏涂片临床样本的蛋白质组，发现正常的Pap测试核心蛋白质组和CVF核心蛋白质组之间存在高度重叠。通过蛋白质组学方法研究细胞粘液，以期描述子宫颈癌早期诊断生物标志物的总蛋白质组。通过2DE-MS和基于凝胶的LC-MS/MS技术相结合的方法对子宫颈粘液蛋白质组进行了特征分析。当高含量蛋白质如白蛋白耗尽后，用2DE-MS分析细胞粘液。3种方法的结合产生了107 种独特的蛋白质，其中大多数涉及新陈代谢，免疫应答和转运。此外，通过荧光染料检测了糖基化和磷酸化的翻译后修饰（post translational modif i cation，PTM），发现急性期血浆蛋白、α-1-抗胰凝乳蛋白酶和α-1-抗胰蛋白酶等分子被磷酸化和糖基化[60]。而在一组独立样本中未尝试验证初始结果，并且差异表达的峰未被鉴定。因此，将来需要分析更多的样本并进行与临床阶段的相关性（Kaplan-Meier/ ROC曲线）分析，以获得可用于早期子宫颈癌诊断的结果。

二、治疗子宫颈癌的药物作用、治疗靶标和作用机制的评估

（一）治疗子宫颈癌的药物作用

体外系统在评估治疗子宫颈癌的药物效应中已广泛应用，一般通过测试不同的药物和许多有希望实现化疗作用的化合物开发新型药物。顺铂是一种广泛使用的化疗药物，其可以破坏DNA，诱导肿瘤细胞凋亡。与放射治疗联合使用，可有效治疗子宫颈癌。为了阐明顺铂的抗增殖机制，使用处理和未处理的Hela细胞进行蛋白质组学研究[61-62]。作者应用基于2DE的蛋白质组学方法，揭示了两组之间差异表达的蛋白质，如顺铂治疗组中I-TRAF和p27Kip的表达上调，而c-myc和PCNA表达下调。通过蛋白质印迹结果提示顺铂可能影响细胞凋亡途径，如众所周知的膜死亡受体（eath receptor，DR）介导的和线粒体介导的凋亡途径[61-62]。

治疗子宫颈癌的另一种常用药物是5-氟尿嘧啶（5-f l uorouracil，5-FU），它是一种嘧啶类似物，可使细胞周期停滞于S期。在Hela细胞系（HPV18阳性）中通过2DE评价了5-FU和顺铂对子宫颈癌治疗的协同效应。蛋白质印迹分析所示，在用两种药物处理的组中观察到凋亡的下游靶标的表达最高，鉴定出不同组间差异表达的蛋白质（I-TRAF、CIDE-B、c-myc和 SCCA-2）。I-TRAF和 CIDE-B在5-FU和联合处理的Hela细胞中表达上调，而c-myc和SCCA-2在5-FU和联合处理的Hela细胞中表达下调。这项研究阐明了上述药物联合作用的影响，并提示这些药物可以激活膜DR介导的和线粒体介导的凋亡通路[63]。

Yim等[64]研究了另一种药物紫杉醇的作用，通过比较紫杉醇处理的Hela细胞和相应未处理的细胞组，发现caspase-5和caspase-8在紫杉醇处理组中表达上调，而bcl-2和c-myc的表达下调，说明这种药物通过DR介导的和细胞色素c依赖性途径参与细胞凋亡。在同一组的以下研究中，上述蛋白质组学方法也用于阐明紫杉醇对细胞周期停滞的作用。通过MTT分析Hela、CaSki（HPV16+）和C33A（HPV-）细胞系中的细胞毒性效应，将紫杉醇处理的细胞与未处理的对照进行比较，发现了与凋亡相关的差异表达的蛋白TRAIL、caspase-5、caspase-8、bcl-2，并且通过蛋白质印迹法验证。阻滞细胞周期的有丝分裂蛋白BUB3也在紫杉醇处理组中上调，因为有丝分裂G2/M被绕过，BUB3的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）敲除导致细胞周期失调[65]。

在相关研究中，不同药物的作用主要通过对Hela细胞进行评估。Hela细胞是侵袭性腺癌的代表，并且是HPV18阳性的。对几种子宫颈癌细胞系的批判性评估认为，Hela细胞是一种合适的分析药物细胞毒性模型[66-67]。对通常使用的抗癌药物（如顺铂，5-FU，紫杉醇）以及其他天然化合物进行体外测试，研究其细胞毒性和抗子宫颈癌细胞的作用方式。它们中的大多数通过膜DR和线粒体凋亡途径诱导细胞毒性。此外，这些药物可诱导细胞周期停滞和氧化应激。这些初步结果需要通过高灵敏度LC-MS/MS进一步分析，以详细阐明每种药物的作用机制。此外，研究显示所选抗癌药物可能对翻译过程起作用，使蛋白质组学成为上述阐明药物表达机理的有力工具。

（二）子宫颈癌的治疗靶标及作用机制

目前，尽管有广泛应用于诊断的TCT以及适用于导致该病（HPV16和HPV18）最常见HPV类型的疫苗，子宫颈癌发病率仍然居高不下，尤其是在第三世界国家。这主要是由于缺乏基本的筛查和治疗手段。在这种情况下，有必要阐明与子宫颈癌相关的HPV的分子途径以及靶向子宫颈癌肿瘤药物的分子机制。此外，迫切需要能够在最早阶段检测子宫颈癌的新型生物标志物。蛋白质组学可以分析与恶性肿瘤相关的蛋白质组学变化或药物治疗，进而促进实现这些目标。体外模型是评估的第一步，因为它们通常代表稳定的系统，易于处理，并且没有临床样本中观察到的变异性。用于不同HPV类型的代表性子宫颈癌细胞系可用于研究药物治疗或子宫颈癌发生、发展过程中的蛋白质组学变化。相较之下，体外系统存在一定的限制，如高浓度的蛋白质可能会掩盖其他浓度较低的蛋白质，而这些蛋白质往往是我们所感兴趣的。

关于分泌的研究还没有报道。然而，分泌的分子参与细胞间通讯，并且可以促成肿瘤的特定标志。对他们的分析具有挑战性，在蛋白质组学研究中使用临床样品的局限性在于其高度复杂性和不断增加的变异性，另一个限制是用于验证临床样品的可用性，特别是免疫组化所需的组织样品。大多数研究发现有限样本量以及大量的蛋白质检测可能会导致一些假阳性。考虑到临床样本的数量和质量，设计多个重要因素，可以改善这个问题。在数据分析过程中应用适当的统计数据，包括调整多重检测，可在临床样本上理想地区分假阳性和真阳性以确定临床相关性。因此，为了增加结果的有效性，应使用多种方法（如蛋白质印迹、免疫组化、MRM）对蛋白质组学结果的后续验证。迄今为止，SELDI-TOF-MS可以区分正常组和病理组之间的蛋白质模式，但其主要缺点是无法鉴定特定蛋白质[68-69]。与2DE-MALDI-TOF-MS是过去广泛使用的方法，但是该领域正在向能够全面表征蛋白质组的更具体和更灵敏的方法（主要是基于LC-MS/MS的方法）迅速发展[70-71]。在子宫颈癌蛋白质组学方面，大多数已发表的研究都是基于2DE-MALDI-TOF-MS的，但最近一些使用高灵敏度LC-MS/MS方法的报道显著改善了宫颈癌蛋白质组的表征[72-73]。蛋白质组学方法将有助于更好地了解抗癌药物的作用机制以及发现新的生物标志物。

也许，未来的蛋白质组学研究将能够进一步评估导致子宫颈癌的HPV生物学及其相关现象。LC-MS/MS的应用和准确的定量（iTRAQ、ICAT或labelfree）方法可以增加对现有子宫颈癌的认识，但LC-MS/MS尚未被广泛使用[74-76]。新一代的MS仪器将能够识别低浓度蛋白质，并研究与子宫颈癌发展、诊断和治疗相关的具体PTM。PTM参与了细胞信号转导和细胞间相互作用，在子宫颈癌中具有关键作用[77-79]。PTM将在未来广泛研究，主要研究目的是将特定的修饰与疾病进展及结局联系起来，而不仅是蛋白质表达改变。系统生物学结合现有“OMICS”方法的新兴手段有助于疾病理解和评估高通量技术产生的丰富信息[80-82]。

三、子宫颈癌相关微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作为诊断和治疗靶标的筛选

miRNA是含20～23个核苷酸的小分子RNA，不编码蛋白质，与基因表达的转录调控和肿瘤的致病机制有关，在诊断和治疗中具有重要作用[83-84]。目前已证实的与子宫颈癌有关的miRNA有miR-21、miR-126和miR-143，这些miRNAs用于诊断和治疗子宫颈癌的临床应用正在进一步研究中。子宫颈癌的诊断方法包括分析血清中特异性miRNA水平的变化和miRNA异常高甲基化的测定。miRNA通过基因转录后的调控参与肿瘤发病机制[85-86]。miRNA作为肿瘤诊断标志物和抗癌治疗的使用已经有许多研究。参与肿瘤发生的miRNA分为致癌miRNA和抑癌miRNA[87-88]。miRNA通过结合到靶mRNA的3'-非翻译区（untranslated region，UTR）中的互补序列上，抑制靶mRNA翻译并增加降解从而导致基因表达的下调。miRNA抑制靶基因翻译的机制导致真核生物启动子作用被阻断。包含1个miRNA的RNA诱导沉默复合体结合到mRNA的3'-UTR，诱发CCR4-CAF1-NOT mRNA复合体形成多聚A尾截断，导致下游多聚腺苷酸尾的断裂，减少翻译起始因子的结合并抑制翻译[89]。

最近的研究表明，miRNA诱导的异常调节机制参与多种疾病的发病机制，包括恶性肿瘤，miRNA表达水平在人类肿瘤组织中降低[90-91]。因此，许多miRNA可能具有抑制肿瘤的潜力，包括与p53基因相关的miRNA[92-93]。Georges等[94]和Braun等[95]分别发现miR-192、miR-194和miR-215以p53依赖的方式被DNA损伤所诱导，而Yan等将miR-17、miR-92簇鉴定为在缺氧条件下由p53抑制的miRNA。在筛选调控p53通路的miRNA时，发现miR-29家族（miR-29a、miR-29b和miR-29c）激活p53通路[96-97]。此外，miR-122通过细胞周期蛋白G1正向调节p53通路，miR-125b直接抑制p53，miR-21通过靶向非均一核糖核蛋白K（HNPRK，p53通路正向调控因子）和p53同系物p63负调节p53通路。基于miR-372和miR-373通过LATS2抑制p53诱导的CDK的负调控，miRNA还可以影响下游p53通路[96-100]。

有许多抑癌miRNA的报道，如miR-138参与端粒酶的调节。端粒酶是一种通过在染色体末端延伸端粒而与细胞永生化和癌发生强烈关联的酶，其活性取决于人类端粒酶逆转录酶的表达。MiR-138通过抑制人类端粒酶逆转录酶mRNA水平来降低端粒酶活性。MiR-138在子宫颈癌细胞中的表达显著低于正常组织，从而引起端粒酶活化和癌变。在Hela和C33-A宫颈癌细胞中，过度表达的miR-7抑制细胞生长并促进细胞凋亡，而抑制miR-7表达具有相反的作用。因此，miR-7是一种抑癌miRNA[101-103]。miR-17-5p靶向肿瘤蛋白p53可诱导核蛋白1（tumor protein p53-induced nuclear protein 1，TP53INP1）并抑制细胞生长，导致细胞凋亡。TP53INP1在细胞应激反应中发挥重要作用，如果TP53INP1异位表达，干扰miR-17-5p诱导的细胞生长收到抑制。在子宫颈癌组织中发现了TP53INP1和miR-17-5p之间的类似关系。因此，miR-17-5p也可能是肿瘤抑制因子miRNA。有研究者通过MTT法和流式细胞术分析子宫颈癌细胞中的细胞生长和细胞凋亡，结果显示通过靶向PI3K /Akt / mTOR信号通路miR-125b过表达，从而抑制磷酸肌醇3-激酶催化亚基δ（PIK3CD），进而抑制细胞生长、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤发生[104-107]。

由于核糖核酸酶的存在，RNA进入血液后被迅速降解。因此，最初认为miRNA不存在于血清中，并且细胞中的miRNA通常用于miRNA表达分析[108-109]。然而，2007年发现分泌的miRNA被包含在外泌体和在血液中循环的颗粒状囊泡中，随后发现这些miRNA通过细胞间通讯、经由胎盘和母乳转移的信号转导中发挥作用[110-111]。细胞外分泌的miRNA在肿瘤诊断和治疗中也是有意义的，因为肿瘤患者的分泌miRNA谱与正常志愿者的miRNA分布显著不同。在肿瘤中具有特异性表达变化的miRNA具有基于血浆和血清测试的诊断和预后生物标志物的潜力[112-114]。MiR-126和miR-21存在于血清中并与子宫颈癌相关。在从子宫颈癌患者收集的血清中发现了其他新的候选miRNA标记物。检测发现 miR-21、miR-27a、miR-34a、miR-146a、miR-155、miR-196a、miR-203、miR-34在CSCC中高表达。这些结果表明，血清中的miRNA水平可用于自宫颈癌的诊断，并且一些miRNA可用于预测组织类型和用于子宫颈癌的早期诊断[115-122]。

有趣的是，血清中的几种miRNA已被确定为子宫颈癌淋巴结转移的候选标记物。分析了宫颈癌临床（FIGO）分期Ⅰ至ⅡA期的子宫颈癌患者中治疗前收集的血清中miR-20a和miR-203的表达，发现子宫颈癌患者血清中miR-20a水平显著高于健康者，在淋巴结转移患者中表达更高。子宫颈癌患者miR-203的表达水平与健康志愿者相比有升高的趋势，然而只有当miR-203表达被抑制时才发现有淋巴结转移。分析有淋巴结转移组患者和无淋巴结转移，血清miR-20a的AUC高于miR-203的AUC，说明miR-203是比miR-20a低的标记。Zhao等[123-125]研究显示miR-20a的过表达与组织学分级和肿瘤大小有关。Chen等[126-129]进行了一项对早期子宫颈癌淋巴结转移的miRNA标记物研究，通过qPCR测量miRNA表达水平并确定ROC曲线，发现淋巴结转移的候选标记物是miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p和 miR-4484，并且发现血清中的miRNA比血清中的SCC抗原更能预测淋巴结转移。Huang等[130-134]对子宫颈小细胞癌（small cell carcinoma of the cervix，SCCC）患者进行了miRNA研究，发现相对于早期SCCC患者（FIGO2008分期IB1），在晚期SCCC患者（FIGO 2008 IB2-IV）中7种miRNA（let-7c、miR-10b、miR-100、miR-125b、miR-143、miR-145和 miR-199a-5p）的表达水平显著下降。在淋巴结转移患者中，let-7c、miR-100、miR-125b、miR-143、miR-145和 miR-199a-5p的表达被抑制。Kaplan-Meier生存曲线显示，低表达miR-100和miR-125b的患者预后较差。这些结果提示，筛选miRNA可以有效鉴别早期子宫颈癌的淋巴结转移和预测晚期患者的预后。

目前认为，可通过调节miRNA的表达水平进行抗肿瘤治疗。包括通过使用互补核酸序列或通过降低实际表达水平来抑制在肿瘤中过表达的miRNA功能，也可通过补充miRNA来恢复在肿瘤中水平降低的miRNA功能。这两种策略都使用合成的基于核酸的药物。MiRNA潜在的临床应用越来越被认可，血清中分泌的miRNA可用于肿瘤诊断（包括基于各种miRNA血清水平的变化对子宫颈癌的早期诊断），通过MSP和COBRA检查miRNA基因的异常甲基化在子宫颈癌中是有效的，并且通过对各种miRNA的组合分析可以提高诊断和分期确定的准确性[135-137]。传统siRNA药物开发的知识，应用于治疗子宫颈癌也变为现实。在子宫颈癌中miR-21的抑制剂已经被开发出来，并且目前正在使用新技术来研究该miRNA的抑制。相反，miR-143在子宫颈癌中下调，并且在小鼠中移植人骨肉瘤细胞后通过补充miR-143实现了抗癌效果。因此，未来miRNA补充疗法将成为治疗子宫颈癌的新技术。这些发现提示miRNA特异性个体化治疗和分子靶向治疗的许多方法，并且miRNA可能在子宫颈癌的诊断和治疗中起重要作用。

本文回顾了近年来关于子宫颈癌细胞相关蛋白生物学标志物的发现及其评估技术的更新，从早期的巴氏涂片技术到现在的TCT以及HPV检测技术，诊断、预后和预测性生物标志物的评估也在临床水平上进行，蛋白质组学方法已被广泛应用，进而可开发有效的诊断标志物，包括蛋白、miRNA在内的子宫颈癌的新型标志物被大量鉴定，并逐步应用于临床。但仍需要高质量的研究发现具有良好敏感性和特异性的子宫颈癌新型生物学标志物、诊断及治疗靶标。