人沉默调节蛋白（SIRT6）与凋亡研究进展

陈耀丰，梅湛強，吉圣珺，莫冠文综述；温业良审校

（广东省佛山市第一人民医院呼吸内科，广东佛山528000）

卡路里限制（calorie restriction,CR）在近年的研究里面得到重视，原因是其能够延长许多物种的寿命。热量限制可以降低呼吸过程中产生的活性氧，从而延长物种的寿命，但机制还不确定［1］。2000 年发现在酵母菌内的一种蛋白在CR 过程中可以延长酵母的寿命及减少由年龄导致的疾病，酵母沉默信息调节子2 （silent information regulator 2,Sir2）一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的去乙酰化酶，是人沉默信息调节蛋白（sirtuin）家族中的一员［2］。接下来的研究中，人们逐渐发现，sirtuin 蛋白家族的活动不仅延长酵母菌、蠕虫和苍蝇等模型生物的寿命，而且可以促进人类细胞的存活，此功能依赖于功能性的Sir2［3］。Sir2 酶是一种独特的NAD+依赖性去乙酰化酶，能调控多种生物过程，包括转录沉默、细胞凋亡调控、脂肪动员和寿命调节［4］。哺乳动物体内发现sirtuin蛋白家族有7 个，分别为SIRT1-7，它们调节不同的代谢和应激反应途径［5］。当CR 的时候，在小鼠体内，人沉默调节蛋白6（Sirtuin 6,SIRT6）会下降；而转基因小鼠体内的SIRT6 升高时，可减少甘油三酯及胆固醇积累，减少体内脂肪含量及增加血糖耐受，一定程度上减少由年龄导致的疾病发生。有研究表明，相比较野生小鼠，过表达SIRT6 的雄性小鼠可以延长寿命，而其中可能与血清里胰岛素含量及胰岛素样生长因子水平低有关［6］。

1 SIRT6

SIRT6 主要是一种具有多种催化活性的蛋白酶，其中最为重要的是腺苷二磷酸（adenosinediphosphate, ADP）核糖基化和脱乙酰化，参与了多种细胞活动，另外还有脱酰化和脱棕榈酰化等。在研究中发现，除了延长寿命的能力外，SIRT6 还参与了各种细胞途径，包括：转录控制、代谢、DNA 修复和基因组稳定性、增殖和分化、癌症等。通过将其特定的催化活性定位于不同的基质，SIRT6 能够参与和调节这些不同的细胞过程［7］。

SIRT6 主要定位于细胞核内，可结合脱酰亚染色质、核小体等底物，主要是转录因子［8-10］。它在组成性运转元件羟基端延伸区（carboxy terminal extension, CTE）中有一个7 个氨基酸的核定位信号（nuclear localization sequence,NLS）序列。当这一序列发生突变时，SIRT6 被定位于细胞质［10］。在G1/G0 阶段HeLa 细胞的核仁中也可以发现SIRT6。从CTE 中去除35aa 长的核仁定位信号（nuclear localization signal, NLS）序列的话，核仁中就找不到有SIRT6 蛋白表达。值得注意的是，这种定位是与SIRT6 酶活性关系不大，只有在细胞的G1 期出现［11］；而且在基因的294 和303 位点不受其磷酸化的影响［12］。最近发现，SIRT6 也存在于内质网中，它可以通过去除肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）［13］的赖氨酸K19和K20 的长链脂肪酸酰基-肉豆蔻修饰来调控TNF-α 的分泌。

2 细胞凋亡与SIRT6

细胞凋亡是体内活细胞在接受到生理或病理信号，启动多种基因参与精确调控的程序化的死亡过程，对维持体内稳定状态起到关键的作用［14］。KERR 等首先提出细胞凋亡为程序性的细胞死亡，这一病理过程贯穿在个体生长发育的各个阶段［15］。细胞凋亡的发生会出现特定的形态学改变，细胞泡膜小泡的生成，细胞体质的收缩，细胞核质的浓缩，染色质的凝聚，DNA 降解为小片段，最后形成凋亡小体，被邻近的巨噬细胞吞噬［16-17］。目前认为凋亡的途径有三种。第一种是线粒体途径，也成为内源性途径，此途径共有两类，第一类是依赖Caspase 途径，凋亡信号传导到线粒体，线粒体释放如细胞色素c 等细胞因子，激活Caspase 蛋白家族，导致凋亡发生；第二类为非依赖Caspase蛋白通路，由线粒体释放凋亡诱导因子（apoptosis induce factor,AIF）诱导下游蛋白活化，产生凋亡。第二种为死亡受体路径，被称外源性途径，死亡受体（如TNF、Fas 等）接受到凋亡信号，随机与Fas 相关死亡域蛋白（Fas-associated protein with death domain, FADD）的结合，进而激活Caspase蛋白家族，促进凋亡的发生；第三条是内质网途径，内质网应激导致细胞内钙超载或钙离子稳态失衡一方面激活Caspase 蛋白家族促进凋亡的发生［18］。

2.1 p53、Bax 与Bcl2

p53 是分子量为53kD 的核内磷酸化蛋白的编码基因。正常p53 基因为野生型（wt p53），一旦该基因发生丢失或者突变则称为突变型（mt p53），诱发多种癌变［19］。内源性的凋亡途径主要是由线粒体调控的，而线粒体表面存在着B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）蛋白家族，当接收外源的凋亡信号刺激，即可启动凋亡。在Bcl-2 蛋白成员中，Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）是第一个被鉴定为受p53 调控的。在p53+/+的海马神经元研究中发现，N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）诱导的神经元凋亡中凋亡的3'OH DNA 片段和Bax 蛋白诱导是p53 依赖的，p53+/+的小鼠并不会出现上述DNA 片段及蛋白表达［20］。Bcl-2 和Bax 在细胞内可以形成同源二聚体，也可以以异源二聚体形式存在。Bcl-2、Bax和Bcl-x 三者关系的改变形成一个复杂的凋亡调控系统：Bax 与Bax 形成同源二聚体，进入细胞凋亡程序；当细胞内Bcl-2 蛋白的表达量增多，可促使Bax-Bax 二聚体分离，游离的Bax 与Bcl-2 形成更稳定的Bax-Bcl-2 异源二聚体，使由Bax-Bax 二聚体诱导的细胞凋亡的作用结束。当细胞内的Bcl-Xs 大量表达时，会优先与Bcl-2 形成异源二聚体，游离的Bax 得以形成更多的同源二聚体而诱导凋亡［21］。在研究神经细胞受损凋亡的实验中，头部损伤后4 小时，Bax 蛋白表达升高，伴随Bcl-2 表达下调。与此同时，在这些细胞中也观察到p53 的标记免疫表达。在大鼠受伤后1 天内，观察到不同数量的转移酶d-UTP 镍-末端标记阳性细胞。研究结果表明，p53 的上调和Bcl-2 与Bax 的比值的变化可能导致中枢神经细胞在闭合性脑损伤后的神经细胞凋亡［22］。Bax 基因启动子区域包含4 个同源基因，以达成共识p53 结合位点。有研究表明，Bax 是野生型p53 的主反应基因，可能参与了p53 调控的诱导途径［23］。

在鳞状细胞癌（squamous cell carcinomas,SCCs） 实验中，发现SIRT6 的下调可以模拟microRNA-34a（miR-34a）限制角质细胞形成肿瘤的作用，从一个侧面表明下调SIRT6 后正常角质形成细胞向角质形成细胞肿瘤方向发展［24］。阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）患者的大脑中，SIRT6 蛋白表达水平降低。A020542 是老年斑的主要组成部分，降低SIRT6 的表达，而SIRT6 过表达可以阻止诱导的HT22 小鼠海马神经元上的A020542 DNA 损伤。此外，A020542 诱导的DNA损伤与p53 水平之间存在很强的负相关关系，这是一种参与DNA 修复和细胞凋亡的蛋白质。AD患者大脑中脑细胞表现为凋亡的增加，通过SIRT6蛋白表达水平对凋亡有抑制作用，而且通过对p53的影响起作用［25］。在肝癌细胞中发现，p53 直接激活SIRT6 的表达［26］。

在内毒素脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）处理的人牙髓细胞中发现，SIRT6 表达显著降低，细胞增殖、凋亡升高，Caspase-3 活性增强。SIRT6的过表达明显促进了细胞增殖和抑制凋亡，同时降低了Caspase-3 的活性和对Ku70 的去乙酰化［27］。在肝癌细胞中发现，SIRT6 耗尽的细胞中，Ku70 的乙酰化增加破坏了其与Bax 的相互作用，最终导致Bax 线粒体的转位。表明SIRT6 可以阻断Bax 的线粒体移位，并通过去乙酰化Ku70 降低肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）细胞的凋亡率［28］。

2.2 JNK、c-Jun、c-Fos 与Survivin

c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路中的一条。JNK 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，定位在胞质，也被称为应激活化蛋白激酶（stress activated protein kinase, SAPK）。目前已知的JNK 蛋白激酶的底物有3 种：c-Jun（一种转录调节因子，属亮氨酸拉链家族成员）、ETS 样蛋白1（ETS-like1,ELK-1）、活化转录因子-2（activating transcription factor-2,ATF-2）等。JNK 通路的激活与促凋亡作用关系较大，且与多个通路有关。JNK 通过磷酸化c-Jun 和ATF-2 激活转录因子AP-1（AP-1 是Jun-Jun、Jun-Fos 或Jun-ATF 的二聚体），Fas 配体（Fas ligand,FasL）的启动子内包含有AP-1 等顺式作用元件，致使FasL 表达增强，促进细胞凋亡［29］。JNK/SAPK 激活促进凋亡机制包括：诱导FasL 表达增多，使凋亡相关基因差异表达、调控细胞内Ca2+环境和激活Caspase 家族。CHOI 等［30］以6-羟基多巴胺诱导杂交瘤MN9D 细胞凋亡的实验中发现，MN9D 细胞的凋亡依赖于Caspase 和JNK 的活化以及活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）的产生：活化的ROS 激活JNK，后者再激活Caspase，提示JNK 可能处于凋亡信号传导通路的上游，调控Caspase 蛋白，而Caspase-3可能在下游作为凋亡的效应器［31］。百草枯诱导JNK 活化，c-Jun 磷酸化，使得Caspase-3 前体激活，导致神经元细胞相继死亡，这种效应能在体外被特异性JNK 抑制剂SP600125 阻断。而且，百草枯诱导的多巴胺能神经元死亡能在体内被JNK通路阻断剂CEP-11004 阻断。这说明，百草枯诱导多巴胺能黑质神经元凋亡是由JNK 通路信号级联反应激活［32］。体外实验表明，白藜芦醇能阻止玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa,HS）介导的细胞凋亡，实验中以白藜芦醇预处理细胞，抑制了AP-1 活化［33］。LIN 等［34］进一步报道，玫瑰茄抽提液（Hibiscus sabdariffa extract,HSE）引起的细胞凋亡，是通过JNK/p38MAPK 通路的激活、c-Jun 蛋白的磷酸化，激活凋亡信号，其中包括Fas 介导的信号。

生存素（survivin）是一种通过抑制凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）依赖性凋亡通路和可能的Caspase3/7/9 介导的细胞凋亡抑制凋亡的一种生存蛋白［35-39］。它在发育过程中普遍表达，在大多数正常组织中不存在［35，40-41］，在大多数癌症中［42］存活表达被重新激活，并与肿瘤侵犯和降低患者存活率有关［43］。最近，MIN 等人用小鼠模型对肝癌的发病进行了特异性的分析，证明了启动癌细胞的存活是可控的。由c-Jun、c-Fos（基因片段）、SIRT6 和survivin（凋亡抑制基因）可组成瀑布效应，c-Jun 和c-Fos 是肿瘤发展的重要调控因子，c-Fos 受c-Jun 调控。在肝脏肿瘤启动过程中，c-Jun 通过诱导生存素表达抑制细胞死亡。这个表达式的生存素由SIRT6 控制，调节组蛋白脱乙酰作用和核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）绑定在幸存的启动子。SIRT6 表达是由c-Fos调控的，通过抑制生存来提高细胞的死亡。c-Jun在早期肿瘤分期中对c-Fos 的抑制作用将阻断SIRT6 表达。在子宫内膜癌细胞中，SIRT6 阻滞也表现为SIRT6［44］表达较低。SIRT6 通过与c-Jun和脱乙酰组蛋白3 在Lys9（H3K9）相互作用并抑制胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）信号相关基因的启动子［7］。这里揭示了SIRT6 通过氧化应激激活DNA 双链断裂（double-strand break,DSB）修复的机制。笔者认为应激激活的蛋白激酶c-Jun 氨基末端激酶（JNK）在氧化应激反应中磷酸化SIRT6，这一翻译后修饰有助于将SIRT6 动员到DNA 损伤位点，并要求高效地将聚ADP 核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase-1,PARP1）用于DNA 断裂位点和有效修复DSBs［45］。

2.3 MEK-ERK 信号通路

RAF 活化后使蛋白激酶的激酶（mitogenactivated protein kinase kinase,MEK）环上的丝氨酸残基通过磷酸化而后将其激活，磷酸化后的MEK再将细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase, ERK）激活，进而使许多与胞质和胞膜相连的底物磷酸化。还有报道指出，ERK 被快速地转运进入细胞核，通过去磷酸化作用激活AP-1、ELK-1、虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase, SAP）等涉及增殖反应的转录分子，促进细胞凋亡［46］。

对于SIRT6 与蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MEK/ERK）通路关系的研究，出现了比较有趣的情况，SIRT6 既可作为促癌基因，又可对某些肿瘤起到抑制作用。KIM 等［47］发现，在肺癌细胞中，SIRT6 的降解是通过蛋白激酶A（PKA）依赖性抑制Raf-MEK-ERK 通路介导的，而减少SIRT6 表达增强γ 射线诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。接下来的研究发现，非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma,NSCLC）细胞系中SIRT6 过表达增加了细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）磷酸化，激活基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9,MMP9），促进肿瘤细胞迁移和侵袭。在使用特定的丝裂原活化蛋白激酶（MEK）1/2 抑制剂治疗后， 这些效应被消除［48］。 肺鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）是肺癌的主要亚型之一。有研究表明TRA2B-DNAH5 融合是肺SCC中一个新的致癌驱动因素。这种TRA2B-DNAH5融合通过调节SIRT6-ERK1/2-MMP1 信号轴，促进肺SCC 恶性进展［49］。在肝细胞癌研究中发现，SIRT6 表达所需转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1） 和过氧化氢/次氯酸（H2O2/HOCl）（嗜中性粒细胞产生的活性氧自由基）促进肝细胞癌（HCC）的致瘤性细胞。SIRT6改变Smad 和p38 MAPK 通路对细胞衰老的影响，促进ERK 通路对细胞衰老的抑制作用。然而，SIRT6 低效的促进作用导致TGF-β1/H2O2/HOCl 有氧糖酵解和凋亡抵抗［50］。但是，SIRT6 的过度表达降低了肝细胞癌胞内活性氧和超氧阴离子水平。SIRT6 的过表达抑制了ERK1/2 的磷酸化，并通过化学特异性抑制剂U0126 阻断ERK1/2 通路，减弱了SIRT6 过度表达的抑癌效果，表明SIRT6 是肝癌细胞的抑癌基因［51］。同时，有人发现SIRT6 对肾脏有保护作用。SIRT6 基因敲除因顺铂引起的肾脏损伤，而SIRT6 与ERK1、ERK2 和脱乙酰组蛋白3 在Lys9（H3K9）的启动子结合，从而抑制ERK1/2 的表达。此外，抑制ERK1/2 活性可消除SIRT6 敲除引起的肾脏损伤加重。

3 结语及展望

综上所述，SIRT6 在细胞内最重要的酶活性为去乙酰化酶活性和核糖基转移酶，可调控多条凋亡信号通路。目前研究中可发现，SIRT6 可抑制细胞凋亡、抑制肿瘤形成、促进肿瘤细胞凋亡，可能起着延长寿命的作用，但也有研究表明，该蛋白可促进肿瘤的发展。随着人们越来越渴望长寿，SIRT6 的优越性越明显，逐渐成为sirtuins 家族中研究的一个热点。关于SIRT6 的研究处于初级的阶段，仍存在许多问题有待解决。首先，SIRT6 虽然参与细胞众多生命过程调控，但具体机制不清；其次，基于其功能的重要性，SIRT6 本身的调控尤显重要，但目前关于它的调控研究仍较少，可在未来进一步研究；最后，SIRT6 作为药物靶点，可用于治疗相关疾病。