支气管哮喘患儿血清25(OH)D3水平与血清及支气管肺泡灌洗液中microRNA-126的关系

李长青

（新郑市人民医院新生儿科，河南新郑451100）

支气管哮喘是最常见的慢性呼吸道疾病之一，发病率每年都在上升。一些研究表明，维生素D的差异与哮喘儿童的状态存在一定的联系，维生素D 对哮喘的免疫调节功能具有全面的预防作用，但具体机制还不太明确［1］。microRNA-126（miR-126） 是一种内皮细胞特异性微小核糖核酸（microRNA,miRNA），在呼吸系统、造血系统、消化系统及心血管再生中表达［2］。在用卵清蛋白致敏的慢性哮喘模型中，miR-126 在气道中高表达；相反，通过长期施用拮抗剂抑制miR-126 的表达，可以抑制嗜酸性粒细胞募集到气道中［3］。本研究拟检测支气管哮喘患儿血清25-羟维生素D3［25-OH-VitD3，25(OH)D3］水平与血清及支气管肺泡灌洗液中microRNA-126 水平，分析25(OH)D3、microRNA-126 在支气管哮喘中作用和机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017 年1 月至2019 年1 月在该院接受治疗的51 例支气管哮喘患儿（哮喘组）作为研究对象，其中男36 例，女15 例；年龄1～9（6.7±1.1）岁。所有患儿均符合支气管哮喘诊断标准，排除伴有严重心肝肾疾病的患儿，排除1 个月内使用过糖皮质激素以及近3 个月服用维生素D 的患儿。所有患儿依据血清25(OH)D3水平分为3 组，维生素D 适当组（＞30 ng/ml,n=7）、不足组（20～30 ng/ml,n=14）和缺乏组（＜20 ng/ml,n=30）。同期选择15 例因支气管异物接受治疗的患儿为对照组，其中男11 例，女4 例；年龄1～9（6.5±1.2）岁。哮喘组和对照组患儿的性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。研究前，患儿家属均签署知情同意书，并经院伦理委员会批准。

1.2 标本采集

①所有哮喘患儿采取左肺舌叶病变采集支气管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid,BALF），对照组选择非异物侧肺进行灌洗。BALF离心后，上清液置于-70℃保存。②所有患儿入院后均采集空腹血4 ml，3 000 rpm 5 min，取血清置于-70℃保存。酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测各组患儿血清25(OH)D3水平。

1.3 血清及BALF 中miR-126 水平测定

实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）确定miR-126 相对水平。TRIzol 试剂提取总RNA，按照逆转录试剂盒合成cDNA。采用CFX-96 PCR 扩增仪（美国Bio-rad 公司），U6 作为内部参考基因。引物序列由上海英骏公司提供。miR-126 上游序列：5'-GCTGGCGACGGGACATTATTA-3'，下游序列：5'-CCGTGGACGGCGCATTATTA-3'，产物82 bp。反应体系总共为20 μl：10 μl SYBR 预混物Ex Taq™（2x），2 μl PCR 上游引物（5 μmol/L），2 μl PCR 下游引物（5 μmol/L），2 μl 逆转录产物和4 μl 无RNA 聚合酶的水。反应进行45 个循环，变性发生在95℃30 s，然后退火55°C 30 s，72°C 延伸30 s。采用相对定量2-△△Ct法比较目的基因水平。

1.4 肺功能检测

采用英国比特勒肺功能检测仪检测最大呼气流量（peak expiratory flow,PEF）、第1 秒用力呼气容积 （forced expiratory volume in one second,FEV1），并计算第1 秒用力呼气容积占预计值的百分比（FEV1%）和FEV1/用力肺活量（forced vital capacity,FVC）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件，计量资料以均数±标准差（±s） 表示，多组间比较采用one-way ANOVA 分析，组间比较采用t检验。计数资料以百分比（%）表示，采用χ2检验。采用Pearson 进行相关分析，P＜0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 血清miR-126、25(OH)D3 水平以及BALF中miR-126 比较

哮喘组血清25(OH)D3明显低于对照组、血清miR-126、BALF miR-126 明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 不同血清25(OH)D3水平患儿血清miR-126、BALF miR-126 水平比较

各组患儿的血清25(OH)D3、miR-126 以及BALF miR-126 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中缺乏组、不足组、适当组血清miR-126、BALF miR-126 水平明显高于对照组（P＜0.05），缺乏组、不足组miR-126、BALF miR-126 水平明显高于适当组（P＜0.05），而缺乏组明显高于不足组（P＜0.05）。见表2。

2.3 不同血清25(OH)D3水平患儿肺功能比较

各组患儿的PEF、FEV1% 以及FEV1/FVC 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中缺乏组、不足组、适当组PEF、FEV1% 以及FEV1/FVC 水平明显低于于对照组（P＜0.05），缺乏组、不足组PEF、FEV1%以及FEV1/FVC 水平明显低于适当组（P＜0.05），而不足组明显低于适当组（P＜0.05）。见表3。

2.4 相关性分析

血清25(OH)D3水平与BALF 中miR-126 呈负相关（r=-0.521,P＜0.05），与PEF、FEV1%、FEV1/FVC 呈正相关（分别r=0.478、0.432、0.501,P＜0.05）。

表1 血清miR-126 和25(OH)D3水平比较 （±s）

表1 血清miR-126 和25(OH)D3水平比较 （±s）

BALF miR-126 3.47±0.49 7.22±2.59 5.549 0.000组别对照组哮喘组t值P值例数15 51血清25(OH)D3/(ng/ml)38.54±6.43 19.21±5.96 10.849 0.000血清miR-126 3.46±0.52 6.24±1.46 7.207 0.000

表2 不同血清25(OH)D3水平患儿血清miR-126、BALF miR-126 水平比较 （±s）

表2 不同血清25(OH)D3水平患儿血清miR-126、BALF miR-126 水平比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与适当组比较，P ＜0.05；3）与不足组比较，P ＜0.05。

BALF miR-126 3.47±0.49 5.16±1.141)6.06±1.251)2)8.98±1.481)2)3)31.476 0.000组别对照组适当组不足组缺乏组F值P值例数15 7 14 30血清25(OH)D3/(ng/ml)38.54±6.43 32.81±0.841)24.54±2.741)2)15.63±1.761)2)3)155.600 0.000血清miR-126 3.46±0.52 4.78±1.081)5.29±1.231)2)7.25±1.331)2)3)39.340 0.000

表3 不同血清25(OH)D3水平肺功能比较 （±s）

表3 不同血清25(OH)D3水平肺功能比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与适当组比较，P ＜0.05；3）与不足组比较，P ＜0.05。

FEV1/FVC 87.22±1.82 79.26±1.351)73.58±1.521)2)70.18±1.221)2)3)2 487.331 0.000组别对照组适当组不足组缺乏组F值P值例数15 7 14 30 PEF/(L/min)89.27±1.07 71.28±1.421)64.38±1.091)2)50.33±1.581)2)3)2 771.000 0.000 FEV1%/%84.25±1.11 79.28±1.361)76.24±1.471)2)69.46±1.571)2)3)2 548.358 0.000

3 讨论

哮喘的特征是慢性气道炎症、气道高反应性和不可逆的气道重塑，但其发病机制尚不清楚［4］。目前的哮喘治疗主要依靠长期吸入糖皮质激素［5］。虽然糖皮质激素能缓解支气管哮喘，但他们无法控制涉及荷尔蒙的难治性哮喘抵抗和激素依赖性。此外，糖皮质激素易引起副作用，如生长和发育抑制、肥胖［6］。因此，迫切需要进一步了解哮喘的发病机制，并找出治疗气道炎症的新方法。目前的研究显示，合适的循环维生素D 水平对患儿具有保护作用，能有效地减少哮喘［7］。一些流行病学研究表明，妊娠期母亲维生素D 摄入量低与后代喘息表型风险增加有关［8］。本研究中，哮喘组患儿的血清25(OH)D3水平明显低于对照组，这说明哮喘患儿普遍存在维生素D 不足或缺乏。而且通过相关性分析也显示，25(OH)D3水平与PEF、FEV1%、FEV1/FVC 呈正相关，提示25(OH)D3参与了哮喘的发生和进展。

微小RNA（miRNA）为一类小的非编码RNA分子，能够识别特定的靶信使RNA（mRNA）并在转录后调节靶基因的表达水平，作为免疫反应的调节者［9］。 microRNA-126 定位于染色体9q34.3，在肺和心脏组织中高表达，尤其在内皮细胞上能鉴定出microRNA-126 的高表达水平，其可通过抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）途径调节血管生成和血管完整性［10］。一些研究指出，miR-126 在过敏性呼吸系统疾病中异常表达，尤其哮喘患者支气管上皮细胞中miR-126 的表达水平明显上调，并与白细胞介素（interleukin,IL）-13 呈现相关性，可以促进细胞因子IL-13 水平的升高，这表明miR-126可以作为一个相关因素进行研究［11］。而且改变miR-126 已被证明可以改善治疗后的效果，这也表明miRNA 的变化对哮喘症状持续存在至关重要［12］。本研究中，哮喘组患儿的miR-126 相对水平明显高于对照组，表明miR-126 可能参与了哮喘的发生和进展。直线相关分析显示，血清25(OH)D3与BALF 中miR-126 呈负相关，说明25(OH)D3与BALF 中miR-126 共同参与了哮喘的发生和进展。其原因可能是低水平的血清25(OH)D3可能导致系统性炎症的加剧、外周血和BALF 中miR-126 的相对水平增加、免疫系统的失衡。结果炎症细胞释放更多炎症因子，加重疾病严重程度，这也提示miR-126 可能在促进免疫失衡中发挥作用。

总之，低水平25(OH)D3可能促使miR-126 表达在哮喘患儿的外周血及BALF 中上调，并导致免疫失衡，肺功能水平下调，并与疾病严重程度存在一定的联系，因此，miR-126 可用作哮喘辅助诊断和评估潜在血清学标志物。