γδ T细胞在结核病免疫治疗的研究及其应用前景

付亮 梁娟 张国良 吴扬哲 邓国防

据WHO[1]报告，2017年估计有1000万例结核病患者，2/3的患者来自于8个国家：印度(27%)、中国(9%)、印度尼西亚(8%)、菲律宾(6%)、巴基斯坦(5%)、尼日利亚(4%)、孟加拉国(4%)和南非(3%)。结核病死亡患者中，HIV阴性者有130万例，HIV阳性者30万例。2017年，利福平耐药(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)者新发55.8万例，其中82%为耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)；几乎1/2的MDR/RR-TB患者来源于3个国家：印度(24%)、中国(13%)和俄罗斯联邦(10%)。过去60年来，结核病领域的资源大部分用于研究针对结核分枝杆菌的化学药物和化疗方案；结核病药物研发的主要靶点是针对其病原体结核分枝杆菌的必需基因。传统化疗药物在遏制结核病流行方面贡献巨大，但目前其应用遇到了诸多障碍，如MDR-TB流行、共患病(如艾滋病、糖尿病)流行、抗结核药物治疗方案实施过程中的不良反应等。但因抗结核新药的研发力量相对薄弱，亟需探讨新的治疗策略。在严峻的形势下，近年来一系列辅助治疗干预措施，如“宿主靶向治疗”(host-directed therapies，HDTs)开始兴起，并显示了良好疗效，包括老药新用、细胞免疫治疗等。在细胞治疗领域，γδ T细胞是一类不同于αβ T细胞的T细胞亚群，被认为是先天免疫系统的一部分，且可以桥接先天性和适应性免疫。γδ T细胞在不依靠主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)的情况下能够识别感染细胞，从而实现快速和无偏倚的免疫反应。其免疫治疗的安全性和有效性已经在抗肿瘤治疗的临床试验中得到确认。目前，动物实验及人类观察性研究已经证明γδ T细胞在调节结核病患者免疫反应方面有重要作用，其抗结核治疗方面的潜力有待进一步开发。

抗结核药物治疗的现状

一、传统抗结核药物遭遇应用障碍

传统抗结核药物可分为一线和二线，一线抗结核药物有异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、利福布汀、利福喷丁和链霉素，其余归类于二线抗结核药物。为了方便耐药结核病化学治疗药物的选择和方案的设计，根据药物的杀菌活性、临床疗效和安全性，我国将抗结核药物进一步划分为5组[2]：一线口服类抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、利福布汀、利福喷丁)；注射类抗结核药物(链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)；氟喹诺酮类药物(左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星)；二线口服类抗结核药物(乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、环丝氨酸、特立齐酮、对氨基水杨酸、对氨基水杨酸-异烟肼)；其他种类抗结核药物(贝达喹啉、德拉马尼、利奈唑胺、氯法齐明、阿莫西林-克拉维酸钾、亚胺培南-西司他丁、美罗培南、氨硫脲、克拉霉素)。2018年WHO[3]最新指南推荐了用于MDR-TB治疗方案的修订后分组，将结核病药物重新分为3类，并根据有关安全性-有效性平衡的最新证据进行排名：A组为优先考虑的药物：左氧氟沙星和(或)莫西沙星、贝达喹啉和利奈唑胺；B组为下一步必须添加的药物：氯法齐明、环丝氨酸和(或)特立齐酮；C组用于组成完整治疗方案及不能使用A组和B组药物的情况：乙胺丁醇、德拉马尼、吡嗪酰胺、亚胺培南-西司他丁、美罗培南、阿米卡星或链霉素、乙硫异烟胺或丙硫异烟胺、对氨基水杨酸。上述药物通过生物化学和生物物理的作用机制，干扰结核分枝杆菌的代谢过程，削弱其繁殖能力，达到杀菌、抑菌、灭菌的治疗目的[4]。化疗效果与结核分枝杆菌的数量、毒力及其代谢状态、细菌所处的环境，以及宿主免疫状态等因素有关[4]。

事实上，依靠目前的抗结核治疗药物及方案难以达到理想治疗结局，其面临的主要障碍包括[5]：(1)MDR-TB和广泛耐药结核病(XDR-TB)的传播。WHO推荐的治疗方法只能治愈50%的MDR-TB和30%的XDR-TB患者。同时，MDR-TB治疗方案的药物不良反应较大，常常导致治疗中断或治疗力度不足及治疗后复发的问题。(2)结核分枝杆菌的休眠状态。现有的大部分抗结核药物仅能对处于复制期的结核分枝杆菌有效，而休眠的结核分枝杆菌在表型上对这些药物是耐药的[6]。已经有强力证据表明，非复制状态的细菌对抗生素的耐受性更强，导致抗结核疗程时间普遍需要延长(药物敏感性结核病需6个月[7]，耐多药结核病需至少18个月[3])。在6个月标准化疗程中，超过2个月之后的治疗旨在清除持留和耐药的结核分枝杆菌，达到预防结核病复发的目的[8]。基于上述原因，目前迫切需要新的结核病治疗方法，使得能够提高疗效和缩短疗程。

二、HDTs日渐兴起

有效的宿主免疫系统可以防止结核分枝杆菌感染和发病。比如，在结核分枝杆菌和HIV共同感染的情况下，宿主免疫功能减弱可导致疾病易感性增加和治疗效果下降，而增强有益免疫反应则可能成为结核病药物治疗的有效补充[9]。HDTs的靶标是调节宿主对感染的免疫反应[5]。在结核病领域，HDTs的发展主要集中在3个方面[9-10]：(1)调节宿主炎症反应，以减少异常炎症和肺组织破坏；(2)增强宿主固有和适应性免疫反应；(3)调节细菌代谢状态，杀灭结核分枝杆菌。理想情况下，HDTs能缩短结核病患者疗程、预防结核分枝杆菌产生耐药性和减少罹患肺结核后的肺损伤[11]，以帮助宿主控制或消除结核病。

目前，用于辅助结核病治疗的HDTs包括[9]：(1)小分子药物。包括糖皮质激素及其受体激动剂、类花生酸类物质、他汀类药物、磷酸二酯酶抑制剂、抗肿瘤药物、二甲双胍。(2)免疫调节生物制品。包括免疫检查点抑制剂、维生素D3、维生素A、用于免疫治疗的细胞(如：间充质干细胞、γδ T细胞、髓源性抑制细胞)、环境分枝杆菌制剂(母牛分枝杆菌)、微核糖核酸、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)拮抗剂。尽管几种HDTs在临床前研究中显示出一定前景，但需要进一步研究以评估HDTs对结核分枝杆菌感染和疾病不同阶段的关键免疫功能的影响。特定HDTs的应用时机可能至关重要，因为促炎和抗炎的免疫机制在结核病病程的不同阶段具有不同作用[9]。

γδ T细胞的应用已成为当今免疫治疗的热点

采用γδ T细胞进行免疫治疗是HDTs的重要手段之一。γδ T细胞已是当今细胞治疗研究的热点，活化的γδ T细胞具有较强的杀伤活性，具有抗感染、抗肿瘤作用；γδ T细胞还可以维持免疫耐受、调节免疫应答，其异常可导致自身免疫性疾病的发生。国内外研究提示，γδ T细胞在细菌感染性疾病、病毒感染、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、支气管哮喘、皮肤损伤、血液系统肿瘤和实体肿瘤等疾病中发挥着调节作用[12]。

一、γδ T细胞简介

γδ T细胞的首次发现在1984年与1987年间[13]。30余年来，其研究较其他免疫细胞相对滞后，甚至被认为是进化的“残留物(relics)”。但越来越多的研究显示，γδ T 细胞在人的免疫功能中发挥着非常重要的作用。

T细胞可按T细胞受体(T cell receptor，TCR)进行分类：可分为αβ T细胞(也称TCR2细胞，占机体淋巴细胞95%左右，可分为CD4+细胞和CD8+细胞)、γδ T细胞(也称TCR1细胞，多见于发育早期的CD2+CD4-CD8-及CD3+CD4-CD8-胸腺细胞)2个亚群。人体中仅有αβ T细胞、γδ T细胞和B细胞通过体细胞重组来产生抗原受体多样性。人类T细胞中的大多数可重排其细胞受体上的α和β链，被称为αβ T细胞，是适应性免疫系统的一部分。γδ T细胞则受体变异极少，由1条γ链和1条δ链组成[14]。γδ T细胞不受MHC限制，即不需要在抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)上由MHC分子递呈肽，而能够直接而迅速地识别整个抗原蛋白质，并可有效地将抗原递呈给其他T细胞，因此γδ T细胞是固有免疫细胞之一。同时，其又具备部分记忆免疫及适应性免疫特点，能桥连天然性和获得性免疫应答反应[15-16]。

γδ T细胞有如下分类方法[17-18]：(1)分布分类法。γδ T细胞的主要部分分布于一些上皮组织中，另一类γδ T细胞分布在淋巴样细胞和外周血中，其受体构成具有一定的多样性。在健康成人中，γδ T细胞占外周血T细胞的3%至5%。(2)δ链/γ链分类法。根据δ链的不同，γδ T细胞可分为 Vδ1、 Vδ2和 Vδ3等γδ T细胞亚群。其中，Vδ1 T细胞亚群高表达于小肠、皮肤、肺、脾脏、生殖器的黏膜和皮下组织，并参与构成部分表皮间淋巴细胞和上皮间淋巴细胞，可能维持生物上皮黏膜的完整性[19]；Vδ1 T细胞亚群在外周血的细胞含量较少，约占外周血γδ T细胞总量的20%。而Vδ2 T细胞亚群常见于外周血，约为外周血γδ T细胞亚群总量的50%～90%[20]，多数情况下与Vγ9 (也称为Vγ2)链组合成Vγ9Vδ2 (也称Vγ2Vδ2)T细胞亚群，参与机体微生物感染、调节免疫反应。Vγ9Vδ2 T细胞约占外周血γδ T细胞的50%～75%。Vδ3T细胞亚群约为循环T淋巴细胞的0.2%，在血液中含量极少，但在肝脏中含量丰富，在白血病和一些慢性病毒感染的患者中尤为明显[20]。(3)表面分子CD27和CD45RA分类法。中心记忆γδ T细胞(γδ Tcm)，初始γδ T细胞(γδ Tnaive)，终末分化效应γδ T细胞(γδ Temra)，效应记忆γδ T细胞(γδ Tem)。

γδ T细胞参与各种生理学和病理学过程，然而不同的γδ T细胞亚群在乙型肝炎病毒感染、自身免疫性疾病和几种类型的肿瘤中发挥不同甚至相反的作用。γδ T细胞是一种多功能的免疫细胞，其活化后具有强的分泌细胞因子及杀伤靶细胞的功能[12]。γδ T细胞能分泌γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)17等细胞因子，进而参与病原体清除、炎症反应和维持内环境稳定；能高效杀伤肿瘤细胞，其分泌的 IFN-γ也介导一系列抗癌反应。Rei等[21]提到γδ T细胞分泌的IL-17在某些情况下也可能起到促进肿瘤生长和转移的作用。

二、γδ T细胞的增殖和活化

构成人外周血中主要的γδ T细胞群是Vγ9/Vδ2 T细胞，它能特异性地和快速地响应一组非肽磷酸化类异戊二烯前体；后者被统称为磷酸抗原，能产生于所有活细胞。来自动物和人细胞(包括癌细胞)的最常见的磷酸抗原是异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMPP)。

可激活人体Vγ9/Vδ2T细胞的药物，包括合成的磷酸抗原和氨基二膦酸盐，可上调内源性IPP/DMAPP[22]。谢蕾等[23]应用植物血凝素、唑来膦酸、IL-2和 IL-7等刺激外周血单个核细胞，在体外进行大量扩增；培养的γδT细胞具有足够的数量、高纯度、较强的活性、良好的体内外抗肿瘤活性及安全性。国内研究提示，IFN-γ、结核分枝杆菌抗原能增强γδT细胞的肿瘤杀伤功能[24-25]。

体外实验发现，正常人体内的γδ T细胞可被结核分枝杆菌产生的多种磷脂类或多肽类抗原激活并增殖。γδ T细胞在结核分枝杆菌抗原刺激下有很强的增殖能力，对结核分枝杆菌感染有保护作用[26-27]。代光明等[28-29]发现卡介菌(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)和早期分泌靶抗原6(early secretory antigenic target 6，ESAT-6)均可刺激γδ T细胞增殖，并大量分泌IL-17、TNF-α及IFN-γ，且ESAT-6的刺激作用强于BCG。李丽等[30]发现BCG刺激结核性胸膜炎患者的胸腔积液细胞，能诱导记忆性γδ T细胞分泌细胞因子TNF-α及IFN-γ。

三、γδ T细胞应用于肿瘤免疫治疗的现状

近年来，细胞免疫治疗(也称为过继免疫疗法，adoptive immunotherapy)已经成为多种肿瘤治疗的重要手段，被Science杂志列为2013年十大科学突破之首[31]。临床常见的细胞免疫治疗方法包括：细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell，CIK细胞)、嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)和γδ T细胞治疗等[32]。γδ T细胞在同类免疫细胞治疗中的优势包括：γδ T细胞可以快速地在体外和体内特异性大量扩增的同时而不扩增调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)(Treg具有可抑制体内免疫系统控制肿瘤生长的能力)；无需基因改造即有强大的杀伤能力；对于人体内的正常细胞没有杀伤能力；对于血液瘤和实体瘤都有良好的治疗效果[15]。使用γδ T细胞治疗肿瘤已有10余年历史[22]。

目前为止，许多文献报道均利用患者自体的γδ T细胞，或直接体内扩增或体外扩增后回输患者体内，以达到治疗目的。但是，相比肿瘤或传染病患者自体γδ T细胞的功能被抑制或“后天不足”，健康人来源的同种异体γδ T细胞的临床应用价值更具优势，如细胞功能健全、安全、易扩增、成本低、无不良反应、无需基因改造等，其应用前景更加广阔[15]。

γδ T细胞应用于结核病免疫治疗的探讨

T细胞介导抗原特异性适应性细胞免疫应答作为一种精确免疫疗法，已经用于治疗癌症及重症病毒感染，并证明了其安全性和临床疗效。鉴于γδ T细胞免疫治疗在肿瘤领域取得的成效及γδ T细胞的抗感染免疫特性[12]，γδ T细胞免疫治疗与结核病的关系也日渐受到关注和重视。

一、γδ T细胞与结核分枝杆菌感染免疫反应

尽管CD4+αβ T细胞在保护性免疫中的重要性已被证实[33]，近年来认为γδ T细胞在抗结核感染中也起到很重要的免疫防御作用[34-35]。在结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)和早期再激活疾病期间，结核分枝杆菌感染主要位于细胞内，所以T细胞反应对于保护性免疫是至关重要的。CD4+、Th1和CD8+T细胞及其产生的细胞因子(例如IFN-γ、TNF-α和IL-2)参与体内结核分枝杆菌复制的控制[36-38]。然而，这些反应似乎不足以进行细菌清除，因为上述T细胞亚群在活动性结核病期间达到峰值，而在自发免疫未能根除结核分枝杆菌感染后又减少。聚集于黏膜组织中的其他免疫细胞亚群，包括γδ T细胞[39-40]、CD1限制性T细胞和黏膜相关不变性T细胞(mucosa-associated invariant T cell, MAIT cell)也可以影响保护性反应的水平。

γδ T细胞在结核分枝杆菌的固有免疫反应和适应性免疫反应方面发挥重要作用[41]，对于控制结核分枝杆菌感染十分重要。γδ T细胞(主要是Vγ9Vδ2 T细胞亚群)可以直接识别多肽抗原，无需MHC分子帮助，且多肽无需被处理为小分子肽段。重要的是，γδ T细胞可以直接识别结核分枝杆菌表面的包括磷酸类抗原在内的多肽抗原分子，以及结核分枝杆菌的非多肽类抗原分子。陈勇和李柏青[42]证实了γδ T细胞通过其表面的TCRγδ分子可直接结合结核分枝杆菌抗原。细胞表面的受体分子TCRγδ及自然杀伤细胞活化型受体2D(natural killer group 2 member D,NKG2D)等介导了γδ T细胞的抗结核感染过程，同时结核分枝杆菌的蛋白抗原和被感染细胞表面的应激分子会激活γδ T细胞的抗结核免疫反应。γδ T细胞还会分泌穿孔素、颗粒酶B、TNF-α，以及通过Fas/FasL途径杀伤结核分枝杆菌及被其感染的靶细胞[43]；在受到结核分枝杆菌刺激后，还会产生IL-17，通过介导急、慢性免疫反应而保护机体。总之，γδ T细胞不受MHC限制，而是对磷酸抗原介导的递呈作出反应，γδ T细胞的活化导致细胞因子产生和细胞毒反应；另外，γδ T细胞功能在结核分枝杆菌感染期间可以促进常规的分化簇CD4+和CD8+T细胞应答[44]。

司力和张明霞[26]报道，总结γδ T细胞在抗结核感染中主要有以下作用：(1)在呼吸道黏膜能早期活化，是抗结核感染的第一道防线；(2)能识别αβ T细胞不能识别的抗原，与之作用互补；(3)促进肉芽肿形成，γδ T细胞在使巨噬细胞进入肉芽肿的有效移动中有一定作用，γδ T细胞缺陷者可发现较多的脓性肉芽肿；(4)不介导迟发型过敏反应，但能识别自身抗原，引起的免疫反应可导致组织损伤；(5)通过分泌IL-2、IFN-γ(特别是IFN-γ能启动巨噬细胞抗菌机制)在感染初期完善Th1型免疫反应，使αβ T细胞尽早发挥抗结核效应；(6)能溶解结核分枝杆菌感染的靶细胞，γδ T细胞的细胞毒活性主要通过穿孔素/颗粒酶途径和Fas/FasL途径起作用。

二、结核病患者体内的γδ T细胞水平

γδ T细胞在结核分枝杆菌感染中起到保护性免疫反应作用，不同种属的动物感染结核分枝杆菌后，γδ T细胞均有不同程度的改变[34]。而Li等[40]的研究首次证明了结核分枝杆菌反应性Vγ9Vδ2 T细胞亚群的缺失或丧失与疾病之间的强相关性，说明Vγ9Vδ2 T细胞具有保护性作用。Li等[40]发现，在急性感染和原发性感染后外周血γδ T细胞数量明显增多，主要是Vγ9Vδ2 T细胞数量增加，经有效治疗后数量下降；而慢性活动性肺结核患者γδ T细胞数量无明显变化，但进一步发现血液和支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌反应性Vγ9Vδ2 T细胞亚群细胞数量是显著减少的(与LTBI者和非结核性肺部肉芽肿性疾病患者相比)。

刘震天等[45]发现，结核病患者外周血中αβ T和γδ T细胞亚群分布均有显著改变；与αβ T细胞类似，在结核病发病时γδ T细胞数量、功能下降，具有长期记忆性和高分化能力的记忆型细胞减少，都提示这种变化可能不利于机体对结核分枝杆菌感染形成长期有效的抵抗，而不同γδ T细胞亚群免疫亚型的变化在抗结核分枝杆菌感染中的作用有待于进一步研究探讨。唐洁等[46]发现，肺结核患者外周血结核分枝杆菌耐热抗原(结核分枝杆菌-HAg)特异性γδ T细胞显著低于LTBI者和健康者。虞胜镭等[47]发现Vγ2Vδ2+T淋巴细胞在HIV感染和(或)AIDS并发活动性结核病患者中的数量和功能都有受损，提示该类细胞在CD4+T淋巴细胞受到抑制的情况下可能是人体内抵御结核感染的重要免疫细胞。但是，结核病患者的γδT细胞水平并非总是下降的。朱杰华等[48]发现结核性胸膜炎患者的γδ T水平在抗结核治疗前后比较差异有统计学意义，治疗前升高而治疗后下降。但是该研究并未细致区分γδ T细胞亚群。

在LTBI或活动性结核病患者，γδ T细胞发挥功能需要γδ T细胞向肺部运输[49]，而El Daker等[50]观察到γδ T细胞功能特异性地被原位损伤，这表明结核病期间的肺泡环境可能影响了γδ T的驻留。

三、γδ T细胞免疫治疗用于结核病的临床前研究

目前，体外实验、动物实验及人类的观察性研究已经证明，γδ T细胞在结核分枝杆菌感染后的固有和适应性免疫反应方面发挥重要作用。在最具代表性的动物实验中，Qaqish等[51]证实了Vγ9/Vδ2 T细胞亚群对结核分枝杆菌感染具有保护作用。作者使用过继细胞转移策略，发现在接受大剂量(500菌落形成单位)结核分枝杆菌感染的猕猴实验组，在第1周和第3周接受Vγ9/Vδ2 T细胞过继处理，其肺叶和肺外器官结核分枝杆菌感染负荷水平显著低于对照组，且没有(或较少)发生结核分枝杆菌传播到其他肺叶或其他组织；相比之下，对照组则显示了广泛的结核病播散。作者认为Vγ9/Vδ2 T细胞亚群可以用在结核病疫苗开发或HDTs中。其他研究发现，大剂量结核分枝杆菌可导致γδ T细胞缺陷小鼠迅速死亡[35]。但国内外尚无将γδ T细胞免疫治疗应用于结核病的临床研究。

四、存在的问题和展望

时至今日，全球结核病疫情依然十分严峻，耐药结核病的出现对结核病控制造成了极大威胁。传统抗结核药物一般直接作用于结核分枝杆菌，而结核分枝杆菌的生物学特性异常复杂。HDTs可能在标准抗结核治疗之外提供有益补充，能够增强宿主免疫功能而应对外来感染。在过去20余年中，众多学者在γδ T细胞的增殖、活化、同种异体培育方法，以及γδ T细胞参与影响结核感染的作用机制等方面进行了大量研究，揭示了γδ T细胞对宿主的保护作用。在既有的临床前研究基础上，可考虑将γδ T细胞免疫治疗推向临床研究阶段。严谨的HDTs临床试验应该包括安全性、有效性和成本-效益，以及其在体内作用机制的进一步研究。比如，将γδ T细胞联合化疗方案用于多次治疗失败、几乎无药可选的MDR-TB患者，以期缩短疗程、提高治愈率、减少复发率。这或许能成为今后几年颇具希望的研究热点。