热休克蛋白Gp96在肝癌、肝纤维化、乙型肝炎中作用的研究进展

高 熙，李三强

(河南科技大学医学院肝脏损伤与修复分子医学重点实验室，河南 洛阳 471003)

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)Gp96是HSP90家族的重要一员，广泛存在于真核细胞内质网中，在机体应激情况下,发生过表达,并作为分子伴侣调节蛋白质的折叠、转运、分泌和降解，参与多种肝脏疾病的发生、发展过程[1-2]。Gp96在不同肝脏疾病中存在着不同的作用机制。本文就Gp96在肝癌、肝纤维化、乙型肝炎等肝脏疾病中作用的国内外相关研究综述如下。

1 Gp96在肝癌中的作用

肝癌是发病率居我国第4位的恶性肿瘤，居肿瘤致死病因的第3位，严重威胁着人们的健康[3-4]。Gp96高表达于不同恶性肿瘤中，说明Gp96的表达与肿瘤进展之间存在联系[5-7]。多项研究[8-9]表明，Gp96可能在肝癌的发生、发展中起作用。

1.1 Gp96在肝癌发生中的作用Rachidi等[8]采用白蛋白-环化重组酶小鼠与Gp96浮动小鼠杂交来系统研究Gp96在肝癌中的作用。结果表明，Gp96在机体内有着维持肝脏稳态的作用，在人肝癌中的遗传和药理抑制作用干扰了多种生长信号，并抑制了肝癌细胞的增殖。Gp96的失活会促进长链神经酰胺的适应性积累，并伴随着残余Gp96肝细胞的脂肪再生。Gp96背景中的Gp96阳性细胞需要代偿性扩增，使小鼠在Gp96阳性肝细胞中产生致癌物所致的肝细胞增生和肿瘤。Huang等[9]发现高表达Gp96反映了低应答和低存活率。Gp96在肝癌细胞株中的表达高于正常肝细胞系。此外，Gp96的缺失对某些肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用。在小鼠异种移植模型中，当Gp96沉默时可能通过抑制蛋白激酶B(AKT)/内皮细胞一氧化氮合酶通路来显著抑制肝癌细胞的增殖，这提示了Gp96/AKT信号可能是肿瘤治疗的潜在靶点。盛春海等[10]在人肝癌Huh7细胞系中转染了野生型和miR-642a结合位点突变的Gp96 3’UTR的萤光素酶报告基因质粒，并通过PCR和Western-blot等方法检测miR-642a和DOHH的mRNA及其蛋白水平。实验结果发现Gp96 mRNA的3’UTR作为内源竞争RNA可上调肿瘤基因DOHH的表达，促进了肝癌的发生、发展。Chen等[11]采用白蛋白-环化重组酶系统建立了肝特异性Gp96基因敲除小鼠模型，发现Gp96缺乏可导致肝祖细胞过度增殖并伴轻度肝损伤，其与细胞黏附受损有关。肝脏中Gp96的缺失可选择性激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，促进肝癌的发展。Wang等[12]用戊二醛交联法构建了含有分子伴侣Gp96和甲胎蛋白(alpha-fetoprotoine,AFP)的蛋白疫苗来研究Gp96是否能提高AFP的免疫原性以及Gp96能否协同增强AFP治疗效果。结果表明，AFP和Gp96协同作用能够显著增强AFP特异性CD8细胞反应，对AFP表达的肿瘤有显著抗肿瘤作用。吴信华等[13]在探讨抑制Gp96对HepG2细胞中人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表达及细胞增殖的影响中发现，HepG2细胞中Gp96及hTERT的表达较正常均升高，而加入HSP90抑制剂戈尔德霉素可使两者表达显著减少，同时HepG2细胞增殖也明显受到抑制，因此可以说明Gp96在肝癌细胞中通过影响hTERT的活性，从而影响肝癌细胞端粒酶复制和细胞增殖，最终达到影响肝癌的发生、发展的目的。Zhang等[14]发现从H22肝癌细胞中提纯Gp96-肽复合物在体外对小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal exudative macrophage, PEMφ)的免疫功能具有直接激活作用：Gp96不仅可以增加PEMφ杀瘤效应分子一氧化氮和活性氧的产生，增强非特异性抗肿瘤作用，还可以激活PEMφ，上调抗原递呈分子的表达，增强抗原呈递的能力，说明Gp96可以通过影响巨噬细胞的功能来对抗肝癌。Wang等[15]采用人肝癌细胞株SMMC-7721中的Gp96冲击树突状细胞，激活自体T细胞，发现Gp96冲击的树突状细胞具有刺激自体T细胞增殖和诱导SMMC-7721特异性细胞毒性T淋巴细胞的功能，即针对肿瘤特异性抗原，表现出主要组织相容性复合体Ⅰ类限制性细胞毒性；其还可以通过增强人类白细胞抗原Ⅱ类、CD80、CD86、CD83和CD40的表达而诱导树突状细胞的成熟。结果表明，Gp96可以诱导多种抗肿瘤免疫反应，而不需要预先识别肿瘤相关抗原。

1.2 Gp96在肝癌转移中的作用Wei等[16]用一种特异的短发夹RNA下调了Gp96基因在肝癌细胞中的表达，通过伤口愈合迁移、跨孔迁移和侵袭性测定，确定了肝癌细胞的迁移和侵袭性，证实沉默Gp96可抑制肝癌细胞的愈合、迁移和侵袭，并提示Gp96基因敲除可能通过抑制c-Jun信号来抑制肝癌细胞的转移。Wu等[17]研究发现Gp96能够诱导肝癌细胞周期阻滞，并显著减少细胞凋亡。通过分析凋亡相关蛋白来鉴定p53为Gp96客户端蛋白，并推测Gp96作为支架蛋白增强MDM2 E3连接酶活性，从而增加P53的泛素化和降解。P53是一种抑癌基因，其突变体能够使细胞持续增殖、减少凋亡，从而促进肿瘤细胞转移。此外，Gp96基因敲除对体内肝癌细胞生长有明显的抑制作用，促进了细胞凋亡。Hou等[18]发现血浆膜Gp96可以通过调节uPAR增强肝脏的侵袭和转移潜能。他们对88例原发性肝癌患者的浆膜Gp96水平进行了分析，结果表明，浆膜Gp96高表达时，肝脏肿瘤中尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)的表达水平也相应增加。用siRNA靶向浆膜Gp96或阻断浆膜Gp96-uPAR相互作用的特异性单克隆抗体在体外会抑制细胞的生长、存活和侵袭，并抑制肝癌的体内生长和转移。浆膜Gp96通过增加uPAR的蛋白稳定性和信号转导促进肝癌的进展，可能是抑制uPAR介导的肝癌生长和转移的新靶点。

2 Gp96在肝纤维化中的作用

赵彩霞等[19]用四氯化碳促进大鼠发生肝纤维化，观察大鼠肝脏组织的病理学变化及肝纤维化进展的程度，并同时测定Gp96的表达量。结果发现肝纤维化的严重程度与Gp96的表达水平呈正相关，说明Gp96可以促进肝纤维化的发生、发展。

3 Gp96在乙型肝炎中的作用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的重大公共卫生问题。有3.5亿多人长期慢性感染，慢性乙型肝炎患者有高度的危险性发展为肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌[20]。Gp96可能在抗HBV中起着一定的作用。Wang等[21]研究了Gp96介导的细胞免疫和体液免疫在HBV转基因小鼠抗病毒作用中的价值。他们通过乙肝表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)联合免疫联合Gp96诱导抗病毒T细胞和抗HBsAg、HBcAg抗体免疫。通过与未免疫对照组相比，他们发现Gp96处理组细胞对HBcAg的反应明显增强，CD8阳性T细胞浸润明显增加,并且Gp96可使调节性T细胞(T regulatory cells,Tregs )降低30%～40%。实验结果说明, Gp96可能通过增强Balb/c和转基因小鼠的体液和T细胞应答，降低Tregs频率，增强抗HBV的活性。Li等[22]采用从正常小鼠肝脏中分离到的Gp96及其在大肠杆菌中表达的N端片段用于Balb/c小鼠的免疫接种。通过给8组小鼠皮下分别注射磷酸盐缓冲液、Gp96、N端片段、单纯HBsAg、HBsAg Gp96、HBsAg N端片段、HBsAg不完全佐剂、HBsAg N端片段(95 ℃加热30 min)的磷酸盐缓冲液，用酶联免疫吸附试验检测血清抗HBsAg抗体水平后发现，HBsAg与Gp96或其N端片段免疫小鼠血清抗HBsAg抗体的平均滴度明显高于ELISA检测的HBsAg。他们认为Gp96或其N端片段可显著改善HBsAg诱导的体液免疫应答，但不能增强细胞毒性T淋巴细胞反应，提示Gp96或其N端片段可增强HBV感染体液免疫应答。Lin等[23]通过体外共培养实验得出，Gp96刺激可增强Tregs增殖和抑制作用，而Gp96诱导的叉头样转录因子p3、白介素-10和转化生长因子-β1的上调依赖于Toll样受体2和Toll样受体4介导的核因子κB的激活。通过高剂量Gp96免疫激活Tregs，可防止刀豆蛋白A和抗CD137诱导的T细胞肝脏炎症，并可对抗导致肝脏破坏的免疫亢进。

4 结语

Gp96在人体内广泛表达，与肝癌、肝纤维化、乙型肝炎等肝脏疾病的发生、发展密切相关，在肝脏疾病的发生、发展和转移中存在着不同的作用机制，从不同的方面影响着肝脏疾病的进展。因此，对于Gp96的深入研究可以更有助于肝脏疾病的临床诊断，并可以作为肝脏疾病预防和治疗的新靶点。然而由于实验的局限性，对Gp96在肝脏多种疾病中的作用机制、作用特点还有待进一步更加深入的研究。