猪精液冷冻关键技术的研究与分析

龙清孟，毛世明，周 迪，陈光侯，龚 菲，李 平，李 俊，朱宽峰，金穗华

[1.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550018；2.北京田园奥瑞生物科技有限公司，北京 海淀 100089；3.农业部牛冷冻精液质量检测中心（南京），江苏 南京 210095]

近年来，使用猪的原精，经过稀释处理，开展人工授精配种技术，在养猪业中得到广泛推广应用，这一技术具有自然交配不可比拟的优点：1）可以提高良种公猪利用率，加速品种改良；2）解决了猪场存在一定程度母猪自然交配的困扰：如公、母猪体格相差太大，母猪不堪负重；3）解决了某些地方品种的母猪生殖道本身的生理特征不利于自然交配，精液容易倒流等问题；4）可扩大优秀公猪在时间和地域上的利用率，为优秀种猪精液的资源共享提供便利条件，尤其适用地势险要的贵州农村山区，村寨之间、乡镇之间由于交通不便，不便于赶公猪开展自然交配；5）人工授精还可以有效防止公、母猪受到多种疫病接触传染的可能。然而采用猪的常温精液（原精稀释处理）输配，在一定程度上受到时间、空间距离的限制，常温精液保存期一般在3～5 d，常温精液不便于长途运输及途中控温等缺点，无法充分发挥场与场之间优秀种公猪精液的资源共享，因此，目前猪人工授精技术在养猪生产实践中，已经从采用常温精液输配技术，逐渐转移到冻精制作和冻精解冻输配技术上。

现阶段，猪精液的冷冻制作及保存关键技术研究受到了全球养猪业重视和关注，我国猪冷冻精液的研究虽然在技术上已经取得了一定的突破，但是也有很多研究报道了猪的冷冻精液制作在技术上还有待进一步完善[1]。由于猪精子的生物学特性，其精液冷冻制作技术要求不完全与牛、羊的冷冻精液制作技术相同，主要是猪精子在冷冻、解冻过程中更容易受到损伤。因此，深入系统地研究猪精液冷冻机理和生产过程的关键技术，探讨影响猪冻精活力及受精能力的因素，进一步改进猪精液冷冻技术及操作方法，已成为国内外种猪育种生产中渴望解决的急迫问题[2]。目前，国内猪精液冷冻工艺流程基本相同，只是在关键技术环节的具体操作方面各有差异。本研究就目前国内现状，提出有关猪精液冷冻的一些关键技术要点与质量控制等六方面的关键技术环节的见解，以供同行参考。

1 严把原精（新鲜精液）质量关

猪冷冻精液质量的好坏除了受冷冻技术的影响外，还与原精质量密切相关。较多的试验证明，不是每头公猪的原精液或是每一次采集的精液所制作出的冻精，都可以保证得到满意的冷冻效果。按照精液冷冻工艺要求，对于采精公猪（品种、年龄和个体间存在差异）或采集的精液（质量评估）是具有一定的选择性，选择强度要求视所在地区的基础统计确定，通常对于老龄公猪、精液不耐冻的公猪不列为制作冻精对象。其次，精液采集技术是关键，精液采集过程中如果采精员不按标准操作要求（采集前清洁卫生、采集保留中段精液，前段及后段精液弃掉），可对原精质量带来不利影响，直接影响后续的冻精制作质量，因此，这就要求采精人员的操作熟练、规范，使公猪能够得到充分射精，并把握好精液采集过程，弃去最初（近20%、少精子）和最后（可达40%、胶状凝块为主）的无用精液[3]。原精品质检测：要求外观色泽正常乳白色，稍微带一点腥味，无臭味，不允许有脓性分泌物及其他脏污，检测精子密度≥2亿/mL，活率≥90%，活力≥80%，畸形率≤10%。猪原精品质好与否是直接影响冻精制作成功与否的决定性因素，因此猪冻精的前提，必须严把原精源头质量关。

2 稀释液

稀释液不仅是作为扩大精液量的填充成分，更重要的是可对稀释后精子发挥保护作用。通常，稀释液的主要成分均是按照精液（精子）的生物、物理学特性与需要来配制，各畜种间存在差异。

2.1 糖类

以马和猪的精液来说，其稀释液补充糖类似乎较牛、羊的精液更为重要[4]。目前认为就种畜精液常用的保存液中添加糖类主要有：乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等，普遍认为以果糖为佳[5-6]，实际生产中因果糖价格的昂贵，多数仍以使用蔗糖、葡萄糖为主，有的使用果糖只是作为适量添加。李震钟等[7]研究表明，在猪冻精稀释液中，添加2%～4%葡萄糖效果较好，浓度过高对精子的顶体有损害作用；Paulenz等[8]研究发现添加乳糖的效果比蔗糖和果糖好；李青旺等[9]低浓度的葡萄糖（2%～3%）与乳糖（2%～3%）混合使用效果很好；0.05%可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖的稀释液冷冻猪精液，能够显著提高冻精解冻后的精液活力和顶体完整性[10]。

2.2 缓冲物质、非电解质

Tris（三羟甲基氨基甲烷）不仅与柠檬酸盐、磷酸盐作为常用的缓冲剂保持精液适当的pH，并且对于精液的冷冻具有良好作用，很多养猪业发达国家在制作猪的冻精时，使用的冷冻稀释液中都含有 Tris[7]；OEP（Orvus Es Past）是一种含有十二烷基硫酸钠（SDS）的复合物，适宜浓度的OEP能够显著提高猪冻精解冻后的精子活力和顶体完整性（P＜0.05）[11-14]。在稀释液中添加适量合成洗涤剂Tris、OEP（Orvus Es Past/Equex Stm）、CNB（安钠咖）等，对解冻后的精子活力、活率、质膜与顶体的完整性和存活时间等有不同程度的保护作用[10]。研究资料表明，副性腺体分泌物的电离度，比附睾精液可能高10倍，这样常常会使猪精子在短时间内失掉电荷而发生凝集现象[4]。为此，在精液稀释液中加入非电解质物质以缓和副性腺体分泌物的电离程度，常用的非电解质物质除各种糖类外，甘氨酸作为一种极弱的电解质对猪的精液稀释过程中有良好作用[4]。

2.3 防冻害保护剂

卵黄对精子的保护作用，是其所含脂蛋白、卵磷脂类物质可以防止遭受精子冷休克。卵黄中的胆固醇与精子的存活力有关，有助于精子的存活[15]。不仅如此，卵黄的作用如同独特的渗透缓冲器作用一样，存在时可大幅减少高渗性的糖和盐溶液对精子的有害影响[16]。卵黄应来源于健康鸡场的新鲜鸡蛋，稀释液中添加量一般控制在10%～20%之间为宜，加入后应进行充分混匀。特别提醒，在有氧条件下，卵黄中某些氨基酸经酶系统的作用后，可能产生对精子有害的过氧化氢，因此，稀释液必须强调是现配现用。

不可否认，甘油仍是目前家畜精液冷冻的首选抗冻剂，甘油所具有的理化特性，可以保护和减缓精子在冷冻、解冻过程中越过冰晶危险区域（0～-60℃）易受到伤害。不同畜种的精液，在稀释后所需的最终甘油浓度有所不同。目前猪冻精制作中，大多数研究使用甘油的浓度在3%左右，姜兴刚等在猪精子冷冻技术研究中表明：甘油浓度为2%或4%时，平衡60 min冷冻复苏后精子活力最高[17]。甘油在精液冷冻过程中对精子既有保护的一面，甘油（Glycerol）为渗透性冷冻保护剂，在溶液中容易结合水分子，发生水合作用，使得溶液的黏性增加，降低了冷冻时水的结晶过程，从而达到保护精子的作用；又有毒害的一面，甘油对精子顶体有严重损害，会对精子细胞膜造成伤害[18-19]，甘油对精子具有浓度依赖性毒性，这种毒害的发生机理究竟是什么，至今解释仍不够清晰。但有一点是清楚的，甘油的添加可引起稀释液渗透压的升高[20]，从而造成精子细胞的蛋白质变性，导致细胞膜结构的损伤，形成对精子的损伤。有学者称这种现象为“渗透损伤”[21]。最终甘油浓度发生变化引起渗透压的变化，影响了精液冻后活力和Ⅰ类顶体完整率[22]。基于公猪精子的生物学特性，在精液冷冻关键技术上，应采取继续降低甘油浓度。Polge（1976）之所以在532头青年母猪中获得75%受胎率，只是很简单的用了葡萄糖-卵黄液，着重抓了3个关键环节：一是低甘油（1%），二是快速冷冻，三是快速解冻[23]。

2.4 其他添加成分

金穗华等的试验证明，在牛冷冻精液解冻液中添加了咖啡因，在37℃环境温度保存，经检测，结果顶体完整率试验组均高于对照组（P＜0.01），生存指数虽然高于对照组但差异不显著[24]。猪冷冻精液稀释液中添加咖啡因，精子活力试验组显著高于对照组（P＜0.05），顶体完整率试验组同样显著高于对照组（P＜0.05）[25]，显然，适量的咖啡因对于精子的生理活动具有一定的影响，但在实际输精配种过程中，添加了咖啡因的精液受精的效果还有待进一步的验证。当然，不排除有的添加咖啡因是出于商业目的。

稀释液中可以添加乙二胺四乙酸（EDTA）类的保护剂，尤其在冻精制作过程中，一定程度上起到了保护精子抗冷休克作用。

此外，在精液中添加激素，主要是为了使母畜机体发生有利于受精作用的变化。鉴于催产素能引起子宫平滑肌收缩，世文等[26]、徐美芳等[27]及罗旭芳等[28]曾在精液内加入催产素，结果提高了受胎效果。前列腺素（Prostaglandin,PGs）也具有刺激平滑肌收缩的作用。使用同批号牛冷冻精液，在解冻液中添加了前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，简写 PGF2α）的配种试验，结果试验组（n=96）的受精率显著高于对照组（n=120）20.8%（P＜0.01）。从理论上分析，前列腺素可引起子宫的收缩，有利于精子的运行。而且可能刺激卵泡壁基底部的平滑肌收缩，导致卵泡壁破裂，卵子释放[29]。

2.5 稀释液的配制

稀释液配制过程中，使用的试剂要求是分析纯，使用时应精准称量，配制用水为双重蒸馏水或超纯水，甘油在低温黏稠情况下采取水浴加温变稀，以便取量准确，并可用适量稀释液反复冲洗盛甘油容器，避免粘留，保证准确添加量。抗菌素现配现加，每一类稀释液配制完成后分别贴上醒目的文字标签。此外，为确保称量天平的准确性，要求称量天平应在检定周期内，天平应定期检定。

使用商品稀释剂的应严格按照说明书的要求配制稀释液，过期或出现潮解、变色的不能使用。

3 温度影响的关键环节

与牛比较，猪精子对于温度的变化特别敏感。降温过程中会使精子遭到冷休克影响，导致精子的某些生理变化，并与精子活力和受精力有相关联系[3]。为了避免这样的温度打击，不仅需要稀释液中添加应有的各类保护成分，同时还应注意到稀释温度与降温的速率。

3.1 涉及温度的主要环节

猪精液冷冻工艺流程中基本上有11个技术环节涉及到温度条件：原精液活力检测→原精液稀释自然降至室温→转入恒温箱（17℃）中恒温保存→17℃环境条件离心→弃上清液、等温添加无甘油稀释液→置低温柜（3～5℃）降温、平衡→平衡温度下添加含甘油稀释液→平衡温度下封装细管精液→置入冷冻程序仪器进行精液冷冻→细管冻精分装保存→细管冻精解冻→解冻后精子活率质量检测分析。

3.2 技术要点

3.2.1 活力检测 涉及到精液活力的检测，显微镜载物台的温度应控制在37～38℃环境条件下，载玻片、盖玻片也应预先加温。往往因为温度较低影响精子前向运动的速率，导致活力评估失准，影响后续工作质量。

3.2.2 精液稀释 涉及到添加稀释液的应采用等温稀释，根据精液温度调节稀释液温度，不得反向操作，精液与稀释液温差不得超过1℃，加液量要准确，添加时要沿管（杯）壁缓慢加入，并轻轻沿一个方向摇动，混合均匀。使用前，稀释液可以提前放置在恒温水浴箱中预热。

3.2.3 降温、平衡 涉及到降温的均应按照工艺规定的控制时间，采取水浴方式可以减缓降温速度。应用时可按照大约每2～3 min下降1℃[3]。如果需要适当提高降温速率，可采用在水浴中添加冰块的方法加速降温。平衡时，低温柜中的温度必须稳定在3～5℃。按工艺流程已实施降温处理的精液，一定杜绝精液出现温度回升，哪怕是短暂的回温时间也决不允许。

3.2.4 封装、冷冻 封装也有称灌装，目前多使用细管分装一体机，一次完成细管分装、封口和印刷标志的一体化操作。通常，封装是在平衡低温柜中进行，该期间环境温度仍应保持在3～5℃，不得回升。封装后的细管精液需要放置在同温度条件（3～5℃）的托架上，其码放的方向，棉塞端靠近操作者，超声波封口端远离操作者，放入冷冻箱时同样如此放置。冷冻箱提前预冷至同等温度（3～5℃），程序冷冻仪摆放尽量靠近平衡低温柜，上架后的细管精液从平衡柜转移至程序冷冻仪的操作务必迅速，减少精液在空中暴露时间，及时关闭程序冷冻仪的箱盖，然后用程序冷冻仪进行冷冻。参考冷冻曲线4℃至1℃降温速率1.5℃/min，1℃至-140℃降温速率30℃/min，-140℃维持约5 min，然后取出精液浸入液氮。

冷冻仪是由电子计算机控制的全自动冷冻设备，可根据试验研究的需要，设计并获取多条冷冻温度曲线。使用时首先选择电脑中设置的猪精液冷冻最佳温度曲线，精液冷冻和解冻过程的温度原则上是快速通过冰晶危险区域（0～-60℃），精液冷冻温度控制在-140℃左右，初冻温度调节至4℃，控制2 min降至1℃，控制4.7 min内降至-140℃，并在超低温-140℃维持约5 min，冷冻全过程应在10～12 min之内完成。冷冻完成后，迅速打开冷冻仪的箱盖，迅速将冷冻箱连同细管冻精一起浸没在首先已经盛满液氮的泡沫箱中，然后在泡沫箱的液氮界面下，将细管冻精分装入布袋或拇指管（注意在液氮界面下操作），分装完毕后，并迅速转移到液氮罐提筒中保存，注意完全浸泡在液氮面下。提醒：在装入布袋或拇指管时，注意将细管冻精的超声波封口端向上，棉塞封口端向下，不得倒置（以避免细管棉塞端的爆脱）。

3.2.5 冻精解冻质检，稀释输配

（1）每头猪的冻精细管中取1支进行解冻，采用50℃水浴解冻15～16 s后取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用剪刀剪去细管两端将精液移至10～15 mL的离心管中，按照10倍稀释量，加入解冻液（预先在30℃的水浴锅预热），将解冻液稀释好的精液置于30℃的水浴锅10 min，从离心管中吸取4 μL在CASA全自动精子质量分析仪上进行检测分析。

（2）猪冷冻精液解冻输配技术操作方法。①准备好输精瓶。②根据输配量（母猪头数）配置解冻稀释液约40 mL/头。③将配置好的解冻稀释液放入30℃水浴锅中预热，约10 min。④待解冻稀释液预热好后，将猪冷冻精液取出放入50℃水浴锅中解冻，15 s。⑤将解冻好的猪精液分装入输精瓶中，约8～10支细管/瓶，0.5 mL/细管。⑥将预热好的解冻稀释液分装入输精瓶中，约40 mL/瓶。⑦混匀后30℃孵育20 min后进行输配。

3.3 温控设备

凡是涉及到温度参数的仪器设备，应定期进行检定或校准，确认其已满足温度控制的使用要求。必要时可使用检定合格的温度计随机监控。

4 精液离心

离心目的不仅是因为公猪精液量大而精子密度不高，需要缩小体积，有利于精液冷冻保存；而且可以除去精清，精清中存在危害精子的因素，影响精液冷冻和解冻效果。这在马、猪、山羊、狗的精液研究中已被发现[30]。因此，离心已是精液冷冻过程中一项通用的技术要求。精液离心的关键技术要点是对离心转速和离心时间的把握。转速过高或离心时间过长对精子有伤害，Salamon（1973）研究猪精液发现，用1 000 r/min离心10 min，对冷冻后活率有不良影响[19]。为避免和减小离心可能造成对精细胞内物质的渗出，转速与离心时间的选择应以实际离心效果作为参考，笔者不建议离心后精子集中在离心管底部呈块状的效果，此现象一方面不利于精子的转移，同时加大精子转移撞击损伤。对于离心时环境温度的选择，各家虽有不同，但必须注意到离心环境温度与精液温度的一致性。

5 精液冻前的降温、平衡

平衡是指稀释后的精液放置在低温下经历一定的时间。平衡这一步骤是Polge在研究公牛精液冷冻方法时最先提出的，平衡温度在欧美国家通常为4～5℃[30]。平衡的机制至今尚不清楚，平衡通常是指甘油的作用。甘油平衡的必要性，是以冷冻方法和动物种类不同而异。猪精液冷冻降温时间控制在2～3 h，平衡时间不少于1.5～2 h。目前的研究认为，甘油渗透到精子体内需要的平衡实际很快，甘油同精子接触5 s至15 min，已能够对精子产生足够的保护作用[31]。Blackshaw认为，采用这一步骤还可能与细胞的离子平衡的变化有关，精子在稀释后重建离子的平衡可能需要一定的时间[30]。有较多报道认为，延长5℃平衡时间明显提高抗低温打击。

精液在达到平衡温度的同时，还有一个逐步降温（适应）过程。严格地说，是应将降温和平衡的时间分开，不适合笼统叫平衡时间。目前采用一次稀释法（含甘油）的，无法区分降温和平衡的时间，只能统称平衡时间或降温平衡时间。二次稀释法，先加无甘油的稀释液，降温至4～5℃再加含甘油的稀释液作平衡，即可分清降温和平衡的时间。

猪精液冷冻一般多采用二步稀释法，对离心后精液先用不含甘油的预稀释液稀释，后待温度慢慢降至平衡温度条件下再加入含甘油的稀释液[32]。因为，经过降温、平衡，在精子已处于半休眠状态时，缓缓加入含甘油稀释液，这样高渗的稀释打击，对精子的伤害相对要小一些[33]。在低温平衡的条件下，轻轻摆动平衡的精液，同时，采用滴加的方式缓慢的添加甘油稀释液，这样操作似乎更符合上述理论的解释，也许又是一项新的突破。

6 精液冷冻生产过程的质量控制

6.1 质量的不稳定性

活力在0.7级以上的猪原精液，过滤后采用3步稀释法制成冷冻精液，解冻活力在0.3级以上[34]。胡建洪试验，冻后精子活率达到0.513，精子顶体完整率达75.3%，质膜完整精子达51.3%[35]。在批量生产的情况下，活力达到80%以上[2]。上述类似报道较多，精液冻后结果不尽一致，质量差异明显，并带有一定的普遍性。由此可见，这样的冻精质量水平就一个区域性来评价，完全是处于一种不稳定的状态。猪冷冻精液作为一种特殊的生物产品，其质量影响因素诸多，质量极易出现波动，精液冷冻过程中任何一个关键技术环节上的失误可导致全过程的失败。这已引起相关技术人员的关注。为确保猪的精液冻后质量始终处于受控状态，应不定期的对精液质量性状进行评估和追溯分析，及时发现可能影响因素，及时采取相应改进与控制措施。

6.2 生产工艺的改进与规范

猪冷冻精液目前需要解决的是改良精液的冷冻和解冻等操作过程对精子细胞质膜和精子活力等造成的不利影响[1]。以目前现状，为了保证冷冻精液产品质量的稳定与可控，不仅对于该产品生产流程的每一个环节、每一个步骤，均应严格执行标准作业程序。而且应该继续对冻精生产工艺的各个环节进行优化组合[36]，其技术要点与质量控制将是今后实施标准化生产的重要基础。需要尽快出台具有较强的科学性和可操作性的猪冷冻精液技术规范标准，这将有利于该产品质量的提高和推广。