干细胞来源及内耳导入途径的研究进展

田海月向大伟王新兰钟翠萍

1宁夏医科大学临床学院研究生院（银川750003）

2中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院（兰州730050）

3中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院耳鼻咽喉头颈外科（兰州730050）

感音神经性耳聋（Sensorineural hearing loss，SNHL）是耳鼻喉科常见疾病之一。随着人口老龄化、噪音污染、感染及氨基糖苷类抗生素的滥用，其发生率逐年上升。相关数据显示，全球约有4亿人正承受听力障碍疾病的困扰，SNHL占很大比重[1]。2015年的美国，听力障碍造成750,000,000美元的经济损失，这个数字仍持续增长[2,3]。由于耳机的不健康使用，超过百万的青年人群正面临着永久的听力损失[4]。

多种危险因素包括噪声、神经营养因子减少、耳毒性药物、衰老、全身性疾病、遗传变异等均可导致不可逆的听力损失[5]。耳蜗毛细胞（Hair cells，HCs）及螺旋神经节细胞（Spiral ganglionneurons，SGNs）的损伤和变性均可导致SNHL的发生及发展[5,6]，且受损后很难再生。

目前，SNHL的治疗仍是世界医学难题，主要的治疗方法有配戴助听器和人工耳蜗植入，保证治疗效果的前提是有正常数量的SGNs。干细胞技术的研究和应用在医学领域迅速涌现，尽管在其他领域已有了快速发展，但干细胞在内耳中的应用仍较少见[6,7]。用于细胞替代治疗的移植干细胞，具有快速增殖分化为临床所用的潜力[8,9]。随着分子生物学的迅速发展，细胞移植成为各个领域研究的热点，即将有功能的细胞植入内耳，替代因药物毒性、退化、外伤、遗传缺陷而损伤的细胞，以达到治疗SNHL的目的。本文将从内耳移植细胞来源及途径的研究进展进行综述。

1 移植干细胞来源：细胞替代治疗

移植干细胞是一类具有自我更新能力的未分化细胞，在适当的胞内基因调控、胞间联系及环境因素影响下可分化为任何一种目标类型细胞，最终替代体内损伤或缺失的细胞从而恢复机体正常功能。移植干细胞的种类包括内耳干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞及脊根神经节、骨髓间充质细胞及造血干细胞等。干细胞可以迁移到耳蜗各转并分布于鼓阶、前庭阶、中阶甚至蜗轴内，并且自体的移植可避免免疫排斥反应，具有良好的应用价值。内耳干细胞移植是目前研究的热点与难点，但替代损伤的耳蜗HCs和SGNs的研究仍处于动物实验阶段。

1.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞是存在于哺乳动物胚泡囊内的多功能干细胞，是具有全潜能性、持续增殖、自我更新的前体细胞，是干细胞移植的理想选择。胚胎干细胞可被诱导分化为多种细胞、组织，如何定向诱导胚胎干细胞向特异型细胞分化从而替代损伤细胞成为当今研究热点。研究表明[10]，胚胎干细胞以宿主基质细胞为滋养层，与新生小鼠听觉上皮、耳蜗感觉上皮共培养可分别分化为类神经元细胞、胚胎干细胞来源的神经元，主要朝内毛细胞（IHCs）方向伸展，且与IHCs建立了突触联系。MarkA.Parker[11]通过鼓阶将干细胞移植至模型后观察到干细胞向蜗轴螺旋管（Rosental管）和Corti氏器的迁移，赵等[12]进一步观察到移植细胞迁移至中阶，抵达Corti氏器，并且表达myosinVIIA。张[13]利用耳蜗外侧壁的螺旋韧带和血管纹移植干细胞，发现细胞沿基底膜迁移到受损区域并表达Tubulin。Kollet O等[14]发现由损伤部位释放的趋化因子SDF-1可吸引前体细胞抵达损伤部位。Hu等[15]将胚胎干细胞通过蜗轴注射到神经纤维区域分化为胶质细胞。Corrales等[16]通过试验造成鼠耳蜗SGNs细胞损伤而HCs完整，把小鼠胚胎干细胞诱导成的神经前体细胞移植到蜗轴，发现移植物发出突起，通过Rosenthal's canal，经过骨螺旋板，延伸至受损的Corti氏器并逐渐占据耳蜗神经区域。由此可见，干细胞在趋化因子的吸引下抵达受损区域后有向目标细胞分化的趋势。

1.2 内耳干细胞

内耳干细胞位于椭圆囊感觉上皮内，具有多向分化的潜能。与其他类型移植细胞相比，内耳干细胞有更大的潜能分化为HCs，向听觉上皮细胞的定向诱导分化更具有可操作性，更加适合内耳的内环境，在未来临床运用上具有更广泛的治疗前景。其中，前庭上皮胰岛素样生长因子可使耳蜗前体细胞的增殖能力明显增强，转化成类毛细胞从而表达耳蜗前体细胞特有的基因，在培养基中分化形成表达HCs标记物myosinⅦA和espin的细胞并表达类似早期HCs的功能性离子通道[17,18]。首先，内耳干细胞分化表达几率在10%左右，而神经干细胞只有0.1%；其次，在形成静纤毛束结构方面，内耳干细胞更容易完全分化为HCs[19]；最后，内耳干细胞有较强的增殖能力，可以为细胞替代治疗提供充足的细胞源来恢复相应组织器官的功能。

内耳干细胞的治疗应用诸多问题尚待解决：①如何调控干细胞自我更新能力。②如何控制干细胞向特定细胞系分化和提高分化效率。③移植干细胞如何有效整合和功能重建。虽然上述问题真实存在，但相比较其他细胞来源，内耳干细胞仍是重塑HCs再生从而恢复听觉功能治疗耳聋的最佳细胞来源和主要研究细胞

1.3 神经干细胞

神经干细胞来源于具有干细胞特性的海马组织。由于神经干细胞和内耳细胞都来自外胚层和神经前体细胞，因此就内耳细胞移植替代治疗来说，神经干细胞也是一个比较合适的选择。神经干细胞作为诱导分化为听觉系统特异性细胞的重要细胞来源具有以下几个优势：

1、具有自我更新和分化为多种类型细胞的能力。

2、具有很强的可塑性。

神经干细胞移植后可分化为HCs、神经元和胶质细胞，增殖和整合到成年和新生哺乳动物的损伤内耳中。移植入损伤耳蜗的神经干细胞迁移分布到内耳各个部位，包括膜迷路、感觉上皮、螺旋缘等。Hu等[20]把神经干细胞注入耳蜗底端鼓阶处，发现它们迁移到听神经纤维、Corti氏器和SGNs等处并分化为神经胶质细胞。Parker等[21]将胚胎小脑来源的神经干细胞移植到耳蜗鼓阶内，发现干细胞可分化为各类神经细胞。神经干细胞植入后从鼓阶迁移到蜗螺旋管和Corti氏器内，而且耳蜗的微环境可将干细胞诱导分化为耳蜗所需细胞类型。耳蜗蜗轴内的SGNs和Corti氏器感觉上皮细胞可以释放引导神经元从移植区域迁移到目标部位的一系列生长因子，并支持神经元的存活。神经干细胞移植后有效地存活、迁移到功能性区域SGNs，使神经干细胞作为一种外源性细胞移植替代损伤和丢失SGNs细胞成为可能。

1.4 骨髓间充质细胞

骨髓间充质细胞是具有多向分化潜能的干细胞，主要来自成年哺乳动物骨髓的间质微环境中。骨髓间充质细胞不仅可以分化为外胚层的细胞，还可以分泌支持细胞生长的细胞因子，骨髓间充质细胞在生长因子等作用下向神经细胞分化，从而修复受损细胞，是目前能为临床应用的为数不多的一种干细胞[22]。骨髓间充质细胞进行内耳移植的研究重点在于选择导入方式和比较导入后转分化为SGNs神经元数量的不同。Kamiya等[23]将间充质干细胞灌注到外半规管后发现细胞在耳蜗内迁移，适当时间后检测显示听力水平明显提高。Matsuoka等[24]将试验动物SGNs神经元损伤而保持HCs完整，然后通过鼓阶和蜗轴两种途径注射骨髓间充质细胞，发现细胞可以在耳蜗蜗轴内存活却很少在中阶内存活，并且通过鼓阶注射的骨髓间充质细胞不能迁移到蜗轴内。由于中阶内的内淋巴液处于高钾环境，高钾对细胞具有毒性作用，局部环境不适宜骨髓间充质细胞的存活和生长，因此移植细胞不能存活，中阶内干细胞数量极少。除此之外，Corti器的细胞复合体结构-支持细胞间的粘附连接和紧密连接，对移植细胞来说也是一个挑战。

总之，研究领域已通过间充质干细胞移植来进行听力的功能性恢复，但是需要进一步探究间充质干细胞在内耳功能恢复中的确切转分化能力以及重建损失细胞的作用。

1.5 诱导多功能干细胞

诱导多能干细胞是类似胚胎干细胞的一种细胞类型。多能干细胞能够分化成外胚层、内胚层和中胚层[25]，尤其是源自囊胚内细胞团的胚胎干细胞，打开了再生医学的新领域[26,27]。多能干细胞存在于大多数组织中，并从单个胚层分化为细胞，最常见的是间充质干细胞[28,29]。这些细胞最初仅从骨髓中分离出来，现已知存在于各种组织类型中，如脂肪组织、骨、脐带和外周血、羊膜、皮肤、毛囊等。这些细胞具有分化成脂肪组织、骨、软骨和肌肉的能力[30]。虽然能够自我更新，但它们只能分化为一种特定的细胞类型并形成单一的细胞[31,32]。内源性干细胞驻留在所有组织中，对组织稳态和重塑过程非常重要[28,33]。它们起源于个体发育并保持静止状态，直到局部刺激激活它们的增殖、分化或迁移[34-37]。耳蜗解剖复杂，周围有骨质包裹，移植干细胞成瘤后可以迅速破坏精细的器官和邻近的面神经。因此，利用诱导多能干细胞替代治疗的研究关键在于找到调控细胞起始与终止增殖的办法，从而调节细胞循环过程，减少成瘤风险。

大量的听觉辅助方法发展迅速，但现如今在临床中没有任何方法可以通过恢复受损的内耳解剖和生理结构来恢复或改善听觉。随着干细胞的发现和深入研究，通过其修复受损的内耳结构和正常解剖从而使恢复听觉成为可能。干细胞来源分为两种，即激发自身内耳干细胞使其重新获得自我更新及分化能力；异体来源的诱导分化后的内耳细胞修复受损的自身内耳细胞。但其实际应用仍存在较多桎梏，比如自身来源及异体来源干细胞的选择结果是否会影响治疗效果；移植入相应部位的干细胞是否会发挥期待的作用；排斥反应的出现是否会影响自身内耳功能；如何有效精确调控细胞的增殖及凋亡等等。

具有多向分化潜能、自我更新及增殖能力的各类干细胞群是细胞替代治疗的理想选择。但是，各细胞类群存在不同的优势及缺陷。胚胎干细胞的获取受到道德伦理的制约，且在体内无限增殖有造成畸胎瘤的危险。神经干细胞取材因其解剖部位危险而获取困难。骨髓间充质干细胞较易从骨髓中提取，容易培养扩增，有多向分化潜能。移植治疗的最佳方法是采用耳源性干细胞，具有向内耳细胞定向分化的特性，从而重建HCs形态和神经连接，恢复功能。各类干细胞在内耳细胞替代治疗上有着广阔的前景，为SNHL患者的治疗带来希望。

2 内耳移植的途径

内耳的干细胞移植途径是保证细胞替代治疗的一个主要因素。若使干细胞内耳移植实用于临床，必须确保将移植细胞精确地定位于目标部位，保证移植细胞存活率，调控细胞循环增殖程序，最大限度降低其易变性、致瘤性等。移植途径必须确保外源性移植细胞能够精准、高效、高存活率地定位于靶器官，而又不影响宿主器官的功能与正常解剖形态，要以尽可能减少对内耳结构和功能的损伤，最大程度恢复内耳功能为原则。但是因为耳蜗组织解剖位置深在，结构比较复杂，体积小，造成内耳细胞移植替代治疗研究进展缓慢，将移植细胞诱导至目标位置并保证存活率、自我更新及分化能力是目前干细胞移植治疗中亟待解决的问题，所以必须探索出最有效的运送的途径和方法。

干细胞移植方式包括静脉注射[38]、蛛网膜下腔穿刺移植[39]、内耳移植等等。目前，用于外源物质内耳移植的途径有耳蜗外侧壁[13]、圆窗膜、耳蜗底转、鼓阶[40,41]、中阶及蜗轴[42]等。Iguchi等通过小鼠耳蜗外侧壁移植细胞，术后3日听力检查显示耳蜗ABR阈值明显增高并且没有明显的恢复[43]。因此，耳蜗外侧壁径路可以破坏耳蜗功能，改变耳蜗离子内环境和（或）内淋巴电位。除此，经外侧壁方法移植到中阶可能会损伤血管纹和耳蜗血供[44]。为了评估耳蜗外侧壁径路对耳蜗功能的影响，张等[13]比较了耳蜗外侧壁和鼓阶两种径路后发现，两种径路对耳蜗螺旋神经元无明显影响，毛细胞基本无缺失，术后耳蜗ABR阈值急剧升高，但1-2周后恢复并基本稳定；术后1月，两种径路的耳蜗ABR阈值差异无统计学意义。由此，他得出结论：耳蜗外侧壁移植干细胞的方法对耳蜗功能影响有限。分析上述实验结果的差异性原因，可能是术后观察时间不同，Iguchi研究了术后3日的ABR阈值，而张研究了术后1周、2周、1月的ABR阈值情况。耳蜗移植术后ABR阈值恢复需要一定时间。经耳蜗底转和圆窗膜移植干细胞后ABR阈值没有显著变化，只要操作足够精细，两种路径对听力都不会造成显著影响。圆窗膜打孔后暂时的听功能障碍是由圆窗膜注射引起的外淋巴漏造成的，未造成HCs的永久性损伤或缺失。由于内外环境因素导致的耳蜗组织多种屏障损坏，通透性增加，外源性活性物质更容易进入。其次，损害因素造成HCs与SGNs的变性、坏死，导致细胞表形以及内部成分变化，增加受损细胞的敏感性。再次，耳蜗组织内炎性介质加强自身与外界物质之间的粘附性。在良好的操作条件下，外源性物质耳蜗内移植的途径均未引起耳蜗的炎症反应，对听力也无显著影响。Stover[45]实验证实，耳蜗底转途径的神经干细胞转染效率均高于圆窗膜途径并指出耳蜗底转转染效率高有以下几个原因：①经鼓阶注射至外淋巴的深度较大，更能促进外淋巴的流动，从而更好地将移植细胞团运送至耳蜗各个部位；②将钻孔封闭后不可避免地减少耳蜗容积，增加外淋巴的压力，加速外淋巴的流动；③圆窗膜钻孔后淋巴液外漏，减小外淋巴压力；④耳蜗底转钻孔会使骨屑落入鼓阶外淋巴，改变耳蜗内成分的动态平衡，增强耳蜗组织细胞的易感性。他们的实验还[45]证实，圆窗膜注射与耳蜗底转开窗操作方式均未引起中耳感染，前庭功能紊乱等并发症。经圆窗膜注射优势：操作时间短，可保持耳蜗的正常解剖，炎症损伤轻，出血少，但技术难度大，易引起外淋巴漏。耳蜗底转途径优势：视野清晰，安全可靠，可重复多次导入的优点，但可能造成局部出血、组织粘连和骨纤维化等并发症。综上所述，圆窗膜进路能够保持耳蜗自然解剖结构的完整性，无需填补，可自行愈合；经耳蜗底转开窗进路途径标准，应用最多。

Hildebrand等[46]经中阶径路即通过圆窗插入一个经过基底膜的细管，将胚胎外胚层组织移植到已致聋的豚鼠耳蜗，发现移植细胞存在于中阶、鼓阶和前庭阶，由此可见，部分细胞可以在高钾离子浓度的环境存活，但是移植细胞存活量少且整合功能尚不清楚。

Matsuoka[47]等比较鼓阶注射和蜗轴注射两种注射方法的特点，移植细胞分布都主要在鼓阶和前庭阶，而中阶内的分布很少，鼓阶注射方法在蜗轴内没有移植细胞，而蜗轴注射方法可以在蜗轴内看到较多的移植细胞，更有效地到达SGNs附近。外淋巴腔和蜗轴的解剖屏障可能对迁延起阻隔作用，所以蜗轴注射可能是较理想的方式。外淋巴腔和蜗螺旋管的解剖屏障不是绝对的，它们之间可能存在微小的解剖通道，鼓阶注射的干细胞可以沿着该通道到达SGNs，并顺着神经纤维到达Corti氏器附近。鼓阶途径是将干细胞植入外淋巴，移植空间大，流动的外淋巴液有利于移植细胞的迁移及分布，并且鼓阶处的开窗对神经的损伤小，术后听力影响不大[48]。除了上述途径，静脉注射、蛛网膜下腔穿刺移植研究及听神经干径路也是学者们的兴趣所在。刘日渊等[22]认为上述移植治疗方式均可对内耳造成或多或少的损伤，并尝试经蛛网膜下腔穿刺注射干细胞对耳聋进行治疗，并取得相应成果。从解剖角度分析[49]，耳蜗外淋巴液通路可通过耳蜗水管与蛛网膜下腔相通。经蛛网膜下腔注射干细胞从颈髓移动至延髓，再到耳蜗水管、小脑、内听道及大脑等组织。静脉注射的干细胞受内耳微环境影响可向血管内皮祖细胞分化，也可以通过旁分泌的VEGF及损伤部位生成的VEGE提高外周血内皮祖细胞的水平；VEGF亦可通过Rho/MRTF-A信号通路调节干细胞向内皮细胞分化[50]，从而加快耳蜗血管纹内皮细胞损伤的修复，治疗内耳损伤。有关淋巴系统及静脉移植途径植入干细胞治疗耳聋的有效性及其作用机制仍需进一步研究。听神经干径路主要为了替代变性的螺旋神经元，可以同人工耳蜗植入联合进行。移植胚胎干细胞从移植位置沿听神经干向外周和中枢迁移，但迁移到Rosenthal's管的细胞数量较少[51]。内耳门附近，移植神经母细胞到达未受损的听神经干后，细胞在蜗轴分化为螺旋神经元细胞[52]。尽管听神经干移植似乎适合用来移植细胞，但移植细胞不能到达Rosenthal's管[53]。耳蜗移植可部分替代毛细胞，但对于螺旋神经元损伤尚缺乏有效治疗方法。细胞移植为螺旋神经元变性引起的感音神经性耳聋带来了希望。内耳被淋巴液填充，周围包围骨质，内耳移植后，外源性细胞存在于外淋巴液或蜗轴中，外淋巴液主要由离子和葡萄糖组成，仅含极少的生长因子和神经营养因子，而耳蜗仅有一条终末动脉供血，血供较差，由此可见耳蜗不适合外源细胞存活和繁殖。因此，如何把细胞移植到位置深在、解剖复杂、富有间隔及淋巴液的耳蜗，为移植细胞提供合适的微环境，以及如何提高移植细胞在耳蜗内的存活率而不对耳蜗形成进一步的伤害，是开展内耳细胞移植治疗的重点及难点。

内耳独特的生理结构和功能决定了SNHL的治疗不仅需要耳神经生物学研究者的艰苦探索，更需要多学科交叉发展，以提供创造性的研究工具和技术方法。当然，除内耳干细胞移植，基因治疗也在耳聋尤其是遗传性耳聋的防治中发挥重要作用。可通过精准定位至有害等位基因的靶位插入和过表达缺失或下调的基因，从而进行疾病的表型修复，修复损伤、丢失或失功能的内耳成分，减轻环境对于内耳的损伤[54]。

SNHL是耳科常见的发病率最高的致残性感官缺陷，主要发病部位在耳蜗HCs和SGNs，损伤后难以再生。由于其发病机制复杂、致病因素多样等缺乏有效的、有针对性的治疗方案。随着分子生物学研究的深入和基因工程技术的发展，为由老年性、自身免疫性、噪声性、感染性、药物中毒性等因素引起的听觉系统损伤提供了科学基础。虽然助听设备的使用和人工听觉植入技术仍是临床中使用率最高、效果较好的方案，但是，移植干细胞替代治疗在临床中的应用研究也开始处于起步发展阶段。建立有限的毛细胞数量的动物模型，限制了许多分子生物学和生物化学分析，从而需要建立更为稳定的毛细胞体外培养细胞系，获得高效、安全、控释和靶向特异的外源分子内耳递送技术[54]。现阶段面临许多问题，包括干细胞获取、纯化、移植途径、培养鉴定、迁移分化及存活率等问题。干细胞增殖、分化机制相当复杂，使其成功的分化为HCs或SGNs细胞需要找到诱导HCs或SGNs细胞生成的相关因素，应用这些因素到研究中并成功应用于临床，还需进一步深入探索。