B7-H3在胶质瘤免疫研究中的新进展

赵嘉银 范益民

B7-H3由单核细胞、树突细胞和活化的T细胞释放，是一种肿瘤相关抗原，可调节重要的细胞反应，包括增殖、凋亡、黏附、肿瘤转移和免疫[1-6]。B7-H3被证实在胶质瘤患者中呈高表达，并且与患者的肿瘤病理级别呈正相关，与生存期呈负相关[7]。在弥漫性内生脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）患者中，已被证实B7-H3的过度表达与患者的预后、肿瘤的复发呈负相关，并且通过8H9单抗阻断DIPG患者的B7-H3在临床已经取得了令人鼓舞的成果，对于肿瘤免疫治疗在胶质瘤患者中的研究具有重大的意义[8]。本文现围绕抗B7-H3在胶质瘤免疫中的研究新进展，从B7-H3的生理、在胶质瘤中的作用以及抗B7-H3的相关抗体等方面展开综述，以期为抗B7-H3可能成为继手术、放射治疗和化学治疗后的又一重要治疗手段提供理论基础。

一、B7-H3分子结构及其表达

在机体的免疫应答过程中，原始T细胞的受体 （T cell receptor，TCR）与抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）所表达的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）肽复合物相互作用，主要作为第一个信号来触发T细胞的活化，但并不足以完全使T细胞活化。第二个信号由共刺激分子（最重要的是B7-H1/2和B7-CD28）相互作用提供，从而使T细胞完全得到活化。B7家族分子属于共刺激分子免疫球蛋白超家族，已被发现的B7家族成员主要包括B7-1，-2，-H1，-H2，-DC，-H3 和-H4[9]。 其中 B7-H3 分子包含 7个外显子和6个内显子，编码大小为316个氨基酸蛋白。B7-H3属于I型跨膜蛋白，包含氨基酸的一个信号肽，一个细胞外的免疫球蛋白样可变区（immunoglobulin-like variable domains，IgV）和恒定区（immunoglobulin-like constant region，IgC）、一个跨膜区和一个含有45个氨基酸的胞质尾区[10,11]。B7-H3作为免疫共刺激分子在mRNA水平上广泛表达于人类不同组织及其细胞中。但蛋白质的表达却受到了一定的限制，主要存在于非免疫性的静息成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞（endothelial cell，EC）、羊水干细胞上和部分免疫细胞[12]。 最新由Mahnke等[8]研究的DIPG中B7-H3明显增高，更进一步证实了B7-H3在恶性胶质瘤患者中起到负性调控免疫功能的作用，也为进一步研究胶质瘤的免疫治疗奠定了坚实的基础。综上，B7-H3在T细胞介导的免疫调节中起着极其重要的作用。所以针对阻断B7-H3免疫调节通路抗体的研究在T细胞介导的肿瘤免疫中具有深远的意义，并且可能成为未来治疗恶性肿瘤的主要手段。

（一）B7-H3 相关表达

B7-H3又被称为CD276，是一种属于B7-CD28通路的免疫检查点分子。其与B7家族其他成员在氨基酸序列同源方面达20%～27%。在人类和小鼠中分别由9号和15号染色体编码。由两类同种亚型4IgB7-H3和2IgB7-H3组成，属于免疫球蛋白家族，只有4IgB7-H3在胞外区有一个额外的IgC-IgV免疫球蛋白结构域[10,11,13]。B7-H3首先在人类中被报道，然后是小鼠，但在大部分物种中普遍表达[14,15]。在B7-H3的mRNA方面，不同组织及其细胞上均有表达，主要广泛存在于非淋巴组织的心脏、前列腺、肝脏以及淋巴细胞中。尽管在mRNA水平表达广泛，但机体在正常的情况下，其蛋白的表达会在一定程度上却受到限制，这表明在转录过程中调控机制的存在。B7-H3主要存在于非免疫性的静息成纤维细胞、成骨细胞、EC羊水干细胞上。此外，其还存在于一些免疫细胞上，特别是APC。尤其是与调节性T细胞、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或抗 CD40 共同在体外培养，均可诱导树突状细胞上B7-H3的表达[16,17]。单核细胞和单核细胞来源的树突状细胞分别在LPS或细胞因子的诱导分化后均表现为B7-H3的上调[12]。此外，B7-H3也在自然杀伤（natural killer,NK）细胞、B细胞和少数受甲氧苯丙胺/伊屋诺霉素刺激的人类T细胞上被检测[10]。目前发现的B7-H3相关受体主要位于活化的T细胞上，但尚未鉴定出受体的性质，且有可能不单是一种受体的存在。

（二）B7-H3的不同亚型

B7-H3分为4IgB7-H3与2IgB7-H3两种亚型。Wang等[18]通过流式细胞在不同的人细胞系中对4IgB7-H3和2IgB7-H3的表达进行了初步的测定，发现在大多数细胞系中，4IgB7-H3的表达模式比2IgB7-H3更广泛。他们通过免疫组织化学的方法对胶质瘤组织和正常的脑组织进行的研究表明，2IgB7-H3仅在胶质瘤组织中表达，而在正常的脑组织中不表达。相反，4IgB7-H3抗原至少也在一些正常人的脑组织中表达。另外，在胶质瘤中和正常脑组织中，对两种亚型的mRNA进行检测分析表明，4IgB7-H3 mRNA存在于胶质瘤和正常脑组织中，而2IgB7-H3 mRNA仅存在于胶质瘤组织中。可见，2IgB7-H3亚型在正常的脑组织表达中受到了负性调控，从而为胶质瘤患者B7-H3的检测提供了依据。

（三）可溶性B7-H3

Zhang等[15]首次通过实验报道了可溶形式的B7-H3（sB7-H3）的存在。该研究显示在健康人供体的血清中检测到高水平的sB7-H3，同时还发现sB7-H3是从单核细胞、活化T细胞、树突细胞和某些癌细胞中经表面的基质金属蛋白酶切割而来，释放的sB7-H3能够与活化的T细胞上的B7-H3受体（B7-H3R）结合。进一步研究表明sB7-H3同时存在于人的成骨细胞和骨髓基质细胞的上清液中[15]。这就表明sB7-H3也从成骨细胞中释放，并且水平与胚胎发生相关，这就是为什么在脐带血浆中可发现较高水平的sB7-H3[13]。研究表明sB7-H3可与B7-H3竞争性结合T细胞上相关受体，从而达到对B7-H3受体系统的一些未知作用[15]。总之，sB7-H3是存在的，但对细胞-细胞相互作用的影响以及B7-H3在疾病的病理机制中的作用需要进一步阐明。为更深层次的了解B7-H3在胶质瘤免疫中的作用及其相关受体，sB7-H3是一个不可忽略的存在。

二、B7-H3生理功能在胶质瘤发生中的作用

（一）免疫功能

B7-H3类似于PD-L1，具有针对T细胞的抑制作用，并改变免疫的微环境以逃避抗肿瘤免疫应答。最初，B7-H3是作为IFN-γ的共刺激分子和诱导物而被解释的[13]。随后有研究发现B7-H3可以抑制T细胞的增殖，在一项最新的有关弥漫性脑桥胶质瘤的研究中，Wang等[19]发现先天性免疫反应与胶质瘤的恶性程度呈负相关，同时还发现B7-H3的表达与NK细胞相关的免疫反应同样具有负相关性，这恰好与Lee等[20]之前所报道的B7-H3与NK细胞和CD8+T呈负相关的结果相一致。以上结果为B7-H3作为免疫抑制分子提供了强有力的证据[21,22]。同时该分子还与IFN-γ、TNF-α及其他细胞因子的分泌减少有关，其减少有助于免疫的逃避[23]。

（二）非免疫功能

体外研究表明，B7-H3的表达和细胞与纤连蛋白的黏附之间呈正相关，同时也与细胞的迁移和基质的侵袭能力呈正相关，而且表明B7-H3对细胞的转移潜能有一定的帮助[24]。在一项有关黑色素瘤B7-H3的试验中发现，使用shRNA沉默B7-H3可降低这些细胞的侵袭能力，并且延长了注射这些细胞的小鼠无症状存活时间[25]。研究还表明，B7-H3沉默降低了转移相关蛋白的表达，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、信号转导和转录激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）， 以及分泌白细胞介素-8的水平[25]。另有研究表明 B7-H3还可通过JAK3/STAT3/SLUG信号通路来调节胶质瘤的侵袭性，而且证明B7-H3和MMP-2的表达呈现出正相关性[26]。MMP-2主要分解细胞外基质，使细胞从原发肿瘤迁移到周围环境。而且外泌体是癌细胞释放的膜囊泡，可促进癌细胞生长并增加肿瘤的侵袭和迁移[27]。Marimpietri等[27]通过对神经母细胞瘤的外泌体进行分析研究，发现了多种与癌细胞增殖和进展相关的分子，包括细胞骨架相关蛋白、热休克蛋白、纤维连接蛋白以及CD133、CD147和B7-H3等免疫检查点。这些观察结果均表明B7-H3可能通过外泌体活性和细胞间的相互作用在肿瘤扩散中发挥作用。

另一方面，癌细胞的生长离不开稳定的血液供应，而血管是将这些营养物质运输到肿瘤微环境时所必需的。因此，肿瘤血管生成已被作为癌症的另一种标识。血管内皮生长因子是内皮细胞的促分裂原，而且作为血管生成的启动子，不仅如此，血管内皮生长因子还可以促进血管的通透性以及免疫抑制性肿瘤微环境的生成，并且上调B7-H1在树突状细胞上的表达[28]。 Ricci-Vitiani等[28]研究发现在人胶质瘤的样本中B7-H1和内皮细胞生长因子的蛋白表达呈正相关，但并未证实二者调控神经胶质瘤的免疫反应的互相作用方式。遗憾的是目前并没有B7-H3与内皮细胞生长因子的相关研究，但作为与B7-H1同一家族的免疫检查位点，B7-H3在胶质瘤血管的发生上与B7-H1有着类似的地方，这就需要进一步的研究探索。但癌症组织产生血管的能力已经在胶质母细胞瘤中得到了证实，该研究表明胶质母患者的血管内皮细胞与胶质母细胞具有平均60.7%的相同基因组改变，表明了部分血管内皮起源于胶质瘤细胞[28]。因此，了解B7-H3在胶质瘤血管生成中的作用至关重要，可以帮助我们更好地了解B7-H3的功能，从而从不同的角度去制定针对抗胶质瘤免疫的相关抗体，并尽可能减少其带来的负面影响。

三、B7-H3在胶质瘤中的表达

与正常组织形成鲜明对照的是B7-H3在多数恶性肿瘤中呈献出高表达，并与肿瘤的转移、侵袭及恶性程度相关联。多项研究显示B7-H3存在于一系列的脑肿瘤细胞中，其中一项研究利用5B14或CD19抗体（一种与B7-H3结合的抗体）进行免疫组织化学染色，发现76%的神经母细胞瘤样本和100%的髓母细胞流程样本显示B7-H3免疫组织化学染色呈阳性反应[29]。Castriconi等[30]发现B7-H3在高级别胶质瘤的细胞株中表达较高并与患者预后呈负相关。B7-H3比其他靶免疫检查点更常见和更普遍，如CD146和CD133[29]。此外，Baral等[31]发现胶质瘤患者肿瘤细胞中B7-H3的高表达水平与肿瘤的高度恶性相关，同时通过测量脑脊液中的sB7-H3的水平，发现sB7-H3可能在增加脑肿瘤的转移潜能的方面起着重要的作用[31]。Zhou等[32]通过基因微阵列方式及其免疫分析得出DIPG中同样存在着B7-H3的高表达，并与脑干胶质瘤的恶性程度有关，而且与正常样本相比，B7-H3在DIPG样本中呈过表达。同时可作为DIPG的治疗靶点。有研究表明B7-H3可作为肿瘤表面标志，体外细胞株如U87、U251、A172胶质瘤细胞株与神经胶质瘤组织在B7-H3方面均具有较高的表达[10]。因此在目前的研究背景下所显示出胶质瘤患者中的B7-H3呈高表达并与患者的预后呈负相关，与肿瘤的恶性程度呈正相关。

四、抗B7-H3在胶质瘤中的研究进展

B7配体和CD28受体家族已成为肿瘤免疫治疗的理想靶点，其重点是阻断B7-CD28通路的单克隆抗体的开发。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4,CTLA-4）是一种表达于T细胞上的膜受体，与CD28同源，可以与B7家族配体结合从而消减T细胞的活性，而目前针对CTLA-4和B7-1的抗体已经在各种癌症患者的临床治疗中显示出极高的临床效果[33]。所以同样的思路也可以应用于胶质瘤免疫中针对抗B7-H3的治疗。

虽然B7-H3在T细胞上的受体还没有彻底的研究清楚，但是针对B7-H3的单克隆抗体在体外的研究已经获得了初步的成果，一种抗肿瘤相关的B7-H3单克隆抗体(MGA 271)通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)可增强抗肿瘤作用。在小鼠体内，每周给予MGA 271，可以抑制胶质瘤细胞的生长。单克隆抗体可以稳定地与具有生物活性的细胞毒性药物或诱导细胞死亡的化合物结合，一旦其与细胞表面抗原结合，复合物就被内化，释放细胞毒性物质并杀死癌细胞[34]。8H9是一种抗B7-H3的单抗，8H9主要与FG结合，对小鼠B7-H3的结构研究已经表明FG环负责B7-H3抑制T细胞增殖的能力。近年来很多研究促使8H9的人源化和亲和力逐渐成熟，并仍然保持其体外杀伤阳性表达B7-H3的神经母细胞瘤的能力。经放射性碘131(131I)标记，并应用于转移性中枢神经系统神经母细胞瘤患者上，显示出了作为结合性抗体药物在临床上的成功[35]。此外，将131I标记的8H9注入到没有胸腺的裸鼠体内，然后移植到人神经母细胞瘤中，获得了成功的生物学分布[35]。目前用放射性标记8H9治疗腹膜癌、胶质瘤和进展中的中枢神经系统肿瘤的临床试验仍在进行中。

对于抗B7-H3单克隆抗体的研究并不是针对胶质瘤免疫治疗的唯一途径。有学者提出针对B7-H3的小分子抑制剂，其为一种低分子量的有机化合物(二核苷酸、多肽、单糖等)，与特定的生物靶点结合[36]。与抗体相比，其具有制造成本低、口服方便、组织分布大、半衰期短等优点，因此易于使用。另一种针对B7-H3免疫治疗的方法是嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T 细胞技术。 目前，该疗法在治疗人类急性淋巴细胞白血病方面取得了显著的效果[37]。自体T细胞被设计为含有针对肿瘤抗原的CAR，并通过转移给患者以杀死癌细胞。到目前为止，该项技术仅被成功应用于血液系统肿瘤。但人们仍在努力将CAR T细胞疗法转化为对实体肿瘤的治疗。核心要点是靶向必须高表达于肿瘤组织，即正常周边组织低或者缺失，如B7-H3，以避免非肿瘤效应[36]。目前正在对CAR T细胞进行一些优化，希望能单独或在联合治疗中帮助治疗实体癌症。Picarda等[36]根据CAR T细胞的相关研究进展，提出了将上述两种免疫治疗方式应用于胶质瘤患者治疗中，可作为单独的或者联合其他免疫治疗途径的胶质瘤治疗手段。目前首要的是针对胶质瘤细胞特异性的CRA T细胞的研究与制作。

五、结语

B7-H3既有免疫功能，也有非免疫功能。B7-H3在大多数胶质瘤组织中高度表达，并且与胶质瘤的分级和预后呈正相关。与其他免疫检查点相比，B7-H3通路不仅调节天然免疫和适应性免疫，而且通过各种非免疫功能促进癌细胞的侵袭性。因此，B7-H3似乎是未来胶质瘤免疫治疗的独特而有潜力的靶点，其中最有希望的治疗策略之一可能是使用阻断性mAb来阻断B7-H3通路，而且阻断性mAb与化学治疗方案或其他检查点抑制剂联合使用更有可能产生协同抗胶质瘤的作用。同时，寻找其受体并更好地阐明B7-H3通路在免疫应答和胶质瘤发生中的作用是至关重要的，有助于设计更有效的治疗药物以彻底和持久地治疗人类胶质瘤。

综上所述，B7-H3作为未来胶质瘤免疫治疗中独特而有潜力的靶点，有望成为继手术、放射治疗和化学治疗后的又一重要治疗手段。