ANRASSF1与肿瘤的研究进展

黄显聪 王长春 毛伟敏

ANRASSF1（antisense intronic noncoding RASSF1 RNA）也称为RASSF1-AS1，是一个转录自Ras相关区域家族1A（RAS-association domain family member 1A，RASSF1A）的基因位点的反义内含子长链非编码RNA（lncRNA）。研究表明ANRASSF1具有位置特异性调控作用，可以选择性抑制其在RASSF1异构体上所重叠的反义转录区表达，且其转录及转录后水平的调控仅作用于RASSF1A。ANRASSF1在多种肿瘤中过表达，且与RASSF1A的表达呈负相关，在细胞增殖、迁移、细胞周期控制和细胞凋亡等进程中起重要作用，有望作为肿瘤诊断及预后判断生物标志物，并作为RASSF1A位置特异性调控治疗靶点，为肿瘤治疗提供新思路。本文就ANRASSF1在肿瘤中的位置特异性调控机制及临床研究进展进行综述。

1 ANRASSF1的概述

1.1 ANRASSF1的来源

2004年，REIS等［1］首次报道了与 RASSF1A 密切相关的反义内含子非编码RNA——ANRASSF1。该团队通过构建和使用富含内含子转录本的cDNA微阵列平台，在前列腺癌中发现此非编码RNA表达水平与前列腺癌分化程度密切相关，两者呈正相关。随后，该研究组成员NAKAYA等［2］在后续研究中基于公共mRNA和表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）数据库，对人内含子非编码RNA的基因组进行作图及表达分析，发现部分内含子非编码RNA与蛋白编码基因转录自相同基因位点，且两者的表达模式存在关联，提示内含子RNA对蛋白编码基因的外显子有调控作用。ANRASSF1的转录区是与蛋白编码区重叠lncRNA的其中之一。在更早的人类基因核心启动子鉴定结果中，基于人类ESTs数据库进行的生物信息学分析已发现了一个跨越ANRASSF1和RASSF1C转录起始位点的双向启动子区［3-4］，且有研究报道，这种重叠的正义/反义转录区普遍存在［5-7］。

1.2 ANRASSF1的结构及位置特异性

BECKEDORFF 等［8］在前期研究［1-2］基础上，对ANRASSF1进一步深入研究。通过公共ESTs数据库筛查确定ANRASSF1转录区是定位于RASSF1基因上的一个内含子区域，是长度为580 bp的基因组，且位于RASSF1C异构体上游，并与RASSF1A的外显子2相互重叠。与RASSF1基因位点的蛋白编码mRNA对比，ANRASSF1表达呈反义转录。KONG等［9］采用编码电位计算器工具证实ANRASSF1为lncRNA，且若根据lncRNA相对蛋白质编码基因所在的位置进行分类［10-13］，ANRASSF1是一个长度大于200个核苷酸的新型反义内含子lncRNA，主要位于细胞核或细胞质小室内并通过RNA聚合酶Ⅱ转录而来，但不能转录成蛋白［14］。此外，ANRASSF1与RASSF1A基因表达密切相关。ANRASSF1在RASSF1基因位点中的表达独立于蛋白编码基因之外，调控作用仅在RASSF1A启动子区，但并不影响RASSF1C启动子或其他4个相邻的肿瘤抑制基因位点的启动子。因只有与反义转录重叠的RASSF1A亚型受影响，故ANRASSF1介导的基因抑制有高度的位置特异性，其可能通过对RASSF1A的位置特异性进行调控而在肿瘤发生发展中起重要作用。

2 ANRASSF1在肿瘤发生发展中的作用机制

2.1 ANRASSF1介导RASSF1A表达影响肿瘤进展

RASSF1A是一个肿瘤抑制基因，属于RASSF1亚型。RASSF1A基因是肿瘤发生的重要调控因子，已成为研究的热点之一。研究报道RASSF1可调节一系列细胞功能，如RASSF1A可作为Ras效应器而介导K-ras和TNF-α的促凋亡作用；通过微管相关蛋白（microtubule-associated proteins，MAPs）调节微管蛋白动力，影响细胞运动和侵袭能力；通过毛细血管扩张性共济失调突变基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）和C19ORF5维持基因组稳定性；经p120E4F、Cdc20和后期促进复合物（anaphase-promotingcomplex，APC）调控细胞周期等［15-16］。研究发现，在多种肿瘤中RASSF1A常因启动子高甲基化引起沉默而表达缺失，而RASSF1A的高频率沉默在肿瘤发展中起关键作用［17-18］。RASSF1A是ANRASSF1的位置特异性调控靶点，而ANRASSF1可参与RASSF1A基因表达的转录及转录后水平调控。ANRASSF1通过RNA聚合酶Ⅱ转录后，可与RASSF1A的DNA及pre-mRNA相互作用，从而调控RASSF1A表达。且ANRASSF1与RASSF1A表达呈负相关，在各种原发肿瘤及疾病中，其高表达是导致RASSF1A低表达的主要原因，在致使细胞功能紊乱中起重要作用［19-20］。如上所述，ANRASSF1主要通过调控RASSF1A表达而在维持基因组稳定性、细胞周期控制、调节细胞凋亡、细胞运动和细胞侵袭等起关键作用，进而影响肿瘤进展。

2.2 ANRASSF1在转录水平对RASSF1A表达的调控机制

研究表明，在宫颈癌HeLa细胞系、乳腺癌及前列腺癌细胞系中ANRASSF1与RASSF1A的mRNA及蛋白表达水平呈负相关，且ANRASSF1过表达可促进细胞增殖，并抑制细胞凋亡［8，21］。研究发现ANRASSF1在转录水平上对RASSF1A的调控机制为ANRASSF1通过RNA聚合酶Ⅱ转录后，仍可与转录位点相连而形成 lncRNA-DNA 复合物，促使 PRC2（EED、SUZ12和EZH2等）结合至RASSF1A DNA启动子区域，实现组蛋白H3K27三甲基化，从而抑制组蛋白特定氨基酸位置的翻译后修饰，致使染色质致密化和异染色质形成，进而抑制基因转录［8，22-25］。其中有2个显著的特征：一是RASSF1A启动子中的H3K27三甲基化程度取决于与PRC2结合的ANRASSF1水平；二是PRC2的招募仅可在RASSF1A启动子区域导致H3K27me3水平显著升高，在RASSF1C启动子或相邻的基因位点均未见抑制性标记积累。另有研究发现ANRASSF1表达水平的改变仅调控RASSF1A表达，对RASSF1C表达、RASSF1C启动子以及RASSF1位点相邻的基因启动子（具明显特征的肿瘤抑制基因为TUSC2和NPRL2）并未产生影响［26-27］。可见，只有与反义转录重叠的RASSF1A亚型受ANRASSF1表达水平改变的影响，而lncRNA ANRASSF1所介导的基因抑制是以高度位置特异性表观遗传调控的方式起作用。

2.3 ANRASSF1在转录后水平对RASSF1A表达的调控机制

GUO等［28］在心血管疾病的心肌纤维化过程中发现了ANRASSF1在转录后水平对RASSF1A的表达进行负调控。该项研究报道ANRASSF1通过与RASSF1A mRNA的外显子2直接结合而形成RNARNA复合物，抑制RASSF1A mRNA的翻译，降低蛋白表达水平，从而显著促进IL-1β和ROS生成，以及上调 TNF-α、IL-1β、pro-Col-I 和 α-SMA 的 mRNA 表达水平以及 p-p65、NF-κB、TNF-α、α-SMA 和 NF-α、IL-1β的蛋白表达水平。其中，ROS在心肌纤维化中可直接作用及参与细胞因子和生长因子信号转导［29］。NF-κB可以调控DNA转录、细胞因子产生和细胞存活［30］。TNF-α和IL-1β则是促炎性细胞因子，为多种纤维化疾病的关键靶点［31］。Col-I来源于成纤维细胞，在正常细胞的稳态和生长、肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要作用［32］。α-SMA在局部成纤维细胞中过表达［33］。ANRASSF1过表达能激活肥大和纤维化相关的下游信号传导，并增强心肌成纤维细胞的活化和炎症反应，从而加重心肌纤维化，同时亦可能通过调控以上因子而影响肿瘤细胞增殖及迁移能力。

由此可见，ANRASSF1在对RASSF1A基因表达的转录及转录后水平调控中，无论是位置特异性表观遗传调控中经PRC2所致的RASSF1A DNA启动子甲基化沉默，还是RNA-RNA复合物所致的负调控mRNA翻译，均可导致RASSF1A表达水平下调，从而促进细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡，进而在肿瘤发生中起重要作用。

3 ANRASSF1在肿瘤中的表达

目前已有临床研究报道ANRASSF1在前列腺癌、乳腺癌和胃癌等肿瘤中的表达情况［1，34-35］。REIS等［1］在前列腺癌组织的内含子RNA表达谱分析中首次报道了ANRASSF1在前列腺癌组织中异常过表达，且与前列腺癌分化程度呈正相关。IRANPOUR等［34］在分析lncRNA作为乳腺癌诊断及预后指标的研究中发现，与匹配的癌旁组织相比，ANRASSF1在乳腺癌组织，尤其在三阴性乳腺癌组织中高表达，且ANRASSF1表达与her2/neu阴性状态显著相关，而与肿瘤分期、肿瘤大小、ER和PR状态等临床特征无关，认为检测ANRASSF1表达可能有助于三阴性乳腺癌患者制定个体化治疗方案。然而，因纳入研究的样本量较少，该研究未进行与生存时间的相关性分析。KANGARLOUEI等［35］报道 ANRASSF1在胃腺癌细胞中高表达；相较邻近癌旁组织，发现其在胃癌组织中呈高表达，而ANRASSF1与患者临床病理特征的相关性分析表明，ANRASSF1表达与TNM分期、肿瘤分级、肿瘤大小、幽门螺杆菌感染状况无关。可见，在各种肿瘤中ANRASSF1多表现为高表达状态，并参与肿瘤的发生。

4 小结

在人类基因组中，大部分转录RNA是反义表达于已知基因的内含子区。高通量技术使越来越多的lncRNAs被识别，lncRNA转录及转录后水平的作用机制亦得以更深入研究，且揭示了其在多种细胞进程中的关键作用。ANRASSF1作为一个新型反义内含子lncRNA，在多种癌症和疾病发生发展中起关键作用，与RASSF1A基因表达密切相关的ANRASSF1所具有的高度位置特异性调控作用便是一种新型调控机制。目前研究发现ANRASSF1在转录及转录后水平所导致的RASSF1A表达水平下调，可引起细胞显著增殖、迁移及细胞抑制凋亡，从而在肿瘤发生中起重要作用。靶向lncRNAs的治疗方法已经成为一种新的治疗策略，而靶向lncRNAs治疗主要通过诱导位置特异性内源性基因表达上调实现［36-37］。ANRASSF1的治疗靶点有可能逆转PRC2在RASSF1A启动子区引入的抑制性染色质修饰及RNA-RNA复合物所致的RASSF1A mRNA翻译负调控，从而促进RASSF1A表达上调。而lncRNA-ANRASSF1作为ANRASSF1位置特异性调控的治疗靶点，有望作为新的治疗靶点。但目前ANRASSF1在肿瘤中具体作用的信号通路及机制仍不清楚，未来进一步全面了解ANRASSF1的作用机制及其生物学特征，深入研究其在肿瘤与其他疾病发生和发展中的作用，有望为肿瘤治疗提供新的思路。