日本矶海绵共生真菌分离及其代谢产物抑菌活性研究

柴家乐 白雪莲 郑双芝 卢甜甜 李晓菡 陈怡怡 吴丹丹

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310016)

海绵具有特殊的滤食系统，可以使外界菌种在其体内和体表富集，成为共生真菌。海绵共生菌种属复杂，种类多样[1-2]。海绵共生真菌长期生活在宿主体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了互惠共生的关系，因此可能产生与宿主相同或相似的活性次级代谢产物[3-4]。国内外对植物共生真菌的研究报道[5-6]较多，例如已利用紫杉共生真菌发酵生产紫杉醇，该物质为良好的抗肿瘤药物。但是对动物共生真菌的研究[7-8]相对较少，关于海绵的就更少。孟庆鹏[9]曾对海绵菌中可培养的共附生微生物进行研究，发现在4种海绵中有85株共生细菌，并对其功能基因进行了筛选，但未对其共生真菌进行研究。吴琦等[10]对南海海绵共生真菌Emericellav variecolor XSA-07-2的代谢产物结构及活性进行研究，采用色谱分离技术共鉴定出14个新化合物，体外生物活性筛选试验表明，部分多烯α吡喃酮衍生物表现出抗流感病毒和抗肿瘤活性。Sou 等[11]纯化获得48种海绵相关微生物，测定了各品种液体培养的乙酸乙酯提取物的细胞毒性、溶血活性和虾的致死活性。

近年来，致泻大肠埃希氏菌引起的食源性疾病日益受到人们的关注，其引发的出血性肠炎的暴发或散发性病例较为常见，每年约有2.8～4.0亿例人源产肠毒素大肠杆菌感染发病，约造成30～50万人死亡[12]。目前对大肠杆菌所引起的疾病多采用有效的抗生素进行治疗。抗生素的广泛持续使用和不当使用导致大肠杆菌耐药株的不断增多，使临床对大肠杆菌病的治疗变得十分困难，有时甚至找不到可治之药。鉴于此，本课题组以日本矶海绵为试材，采用3种培养基通过划线分离法进行共生真菌的分离，利用形态学观察结合分子生物学检测方法对其进行分类鉴定，以大肠杆菌为受试菌株，对分离获得的海绵共生菌的次级代谢产物进行抑菌活性研究，以期为海绵资源的有效利用和大肠杆菌新的抑菌活性物质的开发提供新方案。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品的采集

日本矶海绵：采自大连星海湾，采样后立即装入采样袋于4 ℃保藏运送至实验室进行试验。

1.1.2 试剂

海水配制：将氯化钠26.518 g、氯化镁2.447 g、硫酸镁3.305 g、氯化钙1.141 g、氯化钾0.725 g、碳酸氢钠0.202 g、溴化钠0.083 g分别溶解至蒸馏水中，混合，定容至1 000 mL[13]；

培养基：马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基(PDA培养基)、马丁培养基、营养肉汁琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(BYP)；

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli1.2812)：中国微生物菌种保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 将冷冻保藏的样品进行自然解冻，去除杂质，用无菌水对海绵表面进行反复清洗3～5次。将最后1次清洗液涂布于PDA培养基上，28 ℃恒温培养3 d，观察是否长菌，如未长菌即可开展后续试验。

1.2.2 日本矶海绵共生真菌分离 用无菌剪将海绵组织剪成小块，置于100 mL无菌水中充分震荡，静置5 min，吸取200 μL上述溶液分别涂布于PDA培养基(蒸馏水配制)、PDA培养基(海水配制)、马丁培养基(海水配制)上，静置，使溶液渗入培养基中，倒置于恒温培养箱中28 ℃培养，观察菌落生长情况。待形成明显菌落的时候，利用划线分离法进行分离，直至获得单一菌种。

1.2.3 共生真菌形态学观察

(1) 菌落形态观察：将分离得到的菌种，采用点植法接种于其对应的培养基上，28 ℃恒温培养。每天观察和记录菌落生长状况，拍摄菌落图片。

(2) 共生真菌显微形态观察：将菌株通过划线分离法接种于培养基上，垂直于划线方向，用无菌镊子将灭菌后的盖玻片斜插入培养基中，将培养皿于28 ℃恒温培养，直至菌丝长至盖玻片约1/2处，取出盖玻片，放在滴有无菌水的载玻片上，观察矶海绵共生真菌的显微形态。

1.2.4 共生真菌分子生物学鉴定 将分离的纯菌种送至上海桑尼生物有限公司进行rDNA ITS测序，首先提取DNA，然后进行PCR扩增，引物设计见表1，PCR扩增反应体系见表2，在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应程序为预变性：95 ℃，5 min；变性：95 ℃，30 s；退火：58 ℃，30 s；延伸：72 ℃，1 min；终延伸：72 ℃，7 min；循环数：35。反应完成后，取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪进行DNA测序。最后进行序列分析，利用BLAST搜索软件将测序结果与GenBank数据库中相关真菌菌株的序列进行比对，获得相似性序列，再用DNAMA9.0软件进行邻接法(Neighbor Joining)聚类系统发育分析，从而确定菌种的分类地位。

表1 引物设计

表2 PCR扩增反应体系

结合菌落形态、显微形态、分子鉴定结果，参照文献[14]确定菌株的分类学地位。

1.2.5 共生真菌代谢产物的抑菌活性研究

(1) 共生真菌代谢产物制备：将各菌株接种于2 L与其对应的液体培养基中，28 ℃，100 r/min条件下，恒温培养7～14 d。发酵液离心(8 000 r/min，10 min)，收集上清液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯合并后减压浓缩至干，称重，用二甲基亚砜(DMSO)溶解备用。

(2) 抑菌活性测定：以大肠埃希氏菌为测试菌株，用BYP培养液在37 ℃恒温摇床上培养3 d。采用血球计数板计数，当菌悬液中细菌浓度为1×105个/mL时采用96孔板微量法测定抑菌活性。试验组每孔加入90 μL菌悬液(1×105个/mL)，加入10 μL代谢产物溶液(DMSO为溶剂，按照3.5.1制备)，5孔为一组，做2组平行。以DMSO为阴性对照，以100 mmol/L青霉素溶液为阳性对照。加样完成后，在37 ℃，100 r/min条件下，置于恒温摇床中培养。以12 h作为一个测定周期，在600 nm波长下测定OD值。按式(1)计算抑制率。

(1)

式中：

c——抑制率，%；

OD1——阴性对照组吸光值；

OD2——试验组吸光值。

1.3 数据处理

所有数据均以3个独立样本的x±SEM表示。采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据进行方差分析后，用Student’s t检验进行2组之间的比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 日本矶海绵共生真菌的分离与鉴定

从日本矶海绵中共分离到33株共生真菌，其中采用PDA培养基(蒸馏水)分离到21株，PDA培养基(海水)分离到7株，马丁培养基(海水)分离到5株。通过对各菌种的菌落形态观察、显微形态观察以及分子生物学鉴定结果分析可知，矶海绵共生真菌分别属于4个属：青霉属、曲霉属、丝衣霉属、红酵母属。其中L18、L19属于青霉属，P7属于红酵母属，L2、L15未能确定其菌种分类地位。具体情况如表3所示。

由表4可知，青霉属和曲霉属的真菌是海绵共生菌的优势菌，二者分离频率之和达87.9%，其中M1呈现典型的青霉菌的菌落形态特征，菌落呈绿色，生长速度快，菌落致密，与L9菌落形态相似，但菌落背面呈橙色，具体种属还需进一步鉴定。M4等8株菌为曲霉属，菌丝向空中不断伸长，生长速度也较快，有些呈黄色，有些呈白色。海绵共生真菌种类多，具有微生物多样性的特点。典型海绵共生真菌菌落图片和显微形态见图1、2。

表3 不同培养基共生真菌分离情况

2.2 分子生物学鉴定及聚类分析

将共生真菌测序结果输入NCBI数据库中进行BLAST比对，将有最高比对度的菌株及匹配编号列于表5中。共生真菌序列与比对后获得相似度较高的菌株序列，录入DNAMA9.0软件进行聚类分析，采用邻接法(Neighbor Joining)构建系统发育树。结果表明，共生真菌分为4个属：青霉属、曲霉属、酵母属、丝衣霉属。据菌落形态特征和显微形态特征及聚类分析可知，L1是桔青霉，M3是杂色曲霉。其中L2、L15、L18、L19、P7与NCBI数据库中的菌种的序列同源性<50%，不能确定其种属。

表4 共生真菌形态特征

图1 部分共生真菌菌落形态特征

图2 部分共生真菌显微形态(放大倍数均为400倍)

2.3 共生真菌的抑菌活性

采用96孔板法测定各菌株代谢产物的抑菌活性，发现L2、L7、M1、M3、M4、P7对于大肠埃希氏菌表现出一定的抑制效果(见表6)。

从表6可知，33株海绵共生真菌中有7株具有抑菌活性。本试验以12 h为检测周期，培养24 h后有7株共生真菌次生代谢产物有一定的抑菌活性，其中M3对大肠杆菌的抑制作用最强，抑制率达(56.66±2.28)%，其次是M1，抑制率为(51.23±6.24)%，二者均高于阳性对照。共生真菌M4的抑制率随时间延长而增强，48 h达最强，为(41.69±6.33)%。其它菌抑菌活性未呈时间依赖性。

3 结论

试验共分离获得33株海绵共生真菌，分子鉴定结合形态观察确定青霉属和曲霉属真菌为海绵共生真菌的优势菌。

表5 NCBI数据库匹配结果

表6 各菌种次生代谢产物对大肠埃希氏菌的抑制效果†

† “-”表示无抑制作用；同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

其中L1是桔青霉，M3是杂色曲霉。针对大肠埃希氏菌进行抑菌活性试验发现，M3等7株共生真菌代谢产物抑菌活性强，具有良好的研究潜质。今后还将利用色谱技术分离和鉴定其化学组成和分子结构，为开发新的抑菌活性物质提供新化合物。此外，试验共分离获得33株海绵共生真菌，菌株数量有限，后续试验还可以通过增加分离培养基种类等方法，进一步挖掘海绵共生真菌资源。