超微粉碎对山银花微粒结构、有效成分及其抗氧化能力的影响

吴 振 詹 永 李 红 杨 勇 谭红军 黄小平 王海燕

(1. 重庆市中药研究院，重庆 400065；2. 重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401123；3. 重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

山银花富含粗多糖、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜类、挥发油类及微量元素等活性成分，特别是绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、咖啡酸等活性成分含量较高，其绿原酸和总皂苷含量一般高于金银花[1-3]。研究表明，山银花及其提取物具有抗氧化[4]、抗衰老[5]、改善肝功能[6]等生理活性。目前，山银花的研究主要集中在种质资源评价[7]、产地差异[8-9]、初加工差异[10-11]、药效与物质基础的相关性[4]等方面，而关于其深加工及产品研发等方面则未见报道。

山银花作为重要的原料，在制剂、保健食品、化工等领域具有重要的应用价值。一般采用山银花提取物或者浸膏居多[12-13]，但本课题组研究发现，山银花超微粉(全粉)对二甲苯致KM小鼠耳肿胀具有非常好的抗炎作用(需进一步探讨揭示其机理)。超微粉碎是近年来食品原料学、生物技术、制剂及材料学方面的一项新技术，利用机械或流体动力的方法克服固体内部凝聚力使之破碎(达到100 μm以下)；食品原料超微粉碎后其营养成分、理化性能、功能活性及加工性能等方面均得到改善，不仅提高了物料粉体的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活性等，甚至还可以将植物的不可食部分(如粗纤维等大分子)通过超微化被人体吸收，赋予产品细腻的口感[14-15]；食品原料的超微粉碎带给它们更多独特性能，将成为食品资源开发的重要手段和主流发展方向。国内外研究[14-15]均表明，超微粉碎是一种将物料转变为易于生物转化和水解的方法。尽管如此，未见有关超微粉碎对山银花影响的报道。因此，本研究拟通过对山银花进行不同粉碎(即普通粉碎和超微粉碎)，比较其微粒结构、活性成分(绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、木犀草苷、咖啡酸等)含量、绿原酸溶出率和清除DPPH自由基(DPPH·)的差异，以期为山银花的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜山银花：忍冬科灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand. Mazz.)，采集于重庆秀山；

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)：纯度≥98%，美国Sigma-Aldrich公司；

溴化钾：色谱纯，天津市光复精细化工研究所；

绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品：HPLC≥98%，中国药品生物制品检定所；

其他化学试剂：国产分析纯；

所用水为双蒸水，所用溶液均自行配制；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9240A型，海齐欣科学仪器有限公司；

三孔电热恒温水槽：DK-8D型，上海齐欣科学仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-2450型，日本岛津公司；

多功能粉碎机：GX-04型，上海远翔食品机械有限公司；

高频振动式超微粉碎机：WZJ6型，济南倍力粉技术工程有限公司；

激光粒度仪：Mastersizer 2000型，英国马尔文malvern仪器有限公司；

傅里叶变换红外光谱仪：Spectrum GX型，美国Perkin-Elmer公司；

中红外DTGS检测器：ALPAAI-4LSC型，美国Christ公司；

HPLC仪：2690-2995型，配蒸发光散射检测器，美国Waters公司；

电子天平：CP-224S型，德国赛多利斯集团。

1.2 方法

1.2.1 普通粉碎和超微粉碎山银花 原料清洗、去除杂质、干燥(时间24 h，55 ℃)；中药粉碎机或超微粉碎(时间20 min)，过60目筛。

1.2.2 傅立叶变换中红外光谱(FT-IR)、扫描电镜(SEM)和粒径分析方法

(1) FT-IR：采用溴化钾压片法。准确取0.30 g溴化钾(色谱纯)和0.03 g样品粉末混匀后进行压片；条件为压力27 MPa，时间1 min；检测条件：DTGS检测器，光谱分辨率4 cm-1，扫描范围4 000～450 cm-1；采用傅立叶变换中红外光谱仪自带的操作软件采集及处理红外图谱。

(2) SEM：采用戊二醛将待测样品进行固定，再用离子溅射仪对样品表面进行镀金，将其置于扫描电镜下观测形态，加速电压为10 kV。

(3) 粒径：采用激光粒度仪分别对山银花超微粉和普通细粉末样品进行粒度测定。

1.2.3 山银花有效活性成分分析 绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙含量测定参照文献[16]30；木犀草苷、咖啡酸含量测定参照文献[16]221。

1.2.4 山银花超微粉和普通粉中绿原酸的溶出度测定 采用桨法[17]。分别准确称取山银花超微粉和普通粉30 g，投入溶出仪中，避免产生气泡，以超声脱气的900 mL超纯水为溶出介质，转速100 r/min，温度为(37.0±0.5) ℃，立即启动仪器，计时；分别于5，15，30，45，60 min各取样2 mL，过0.45 μm 滤膜，得到以超纯水为溶出介质的供试品溶液，HPLC测定绿原酸含量，同时向杯中补充相同温度和体积的超纯水，计算累计溶出率。

1.2.5 超微粉碎和普通粉碎对山银花清除DPPH·能力的影响测定 准确称取山银花超微粉(LMUFP)、普通细粉(LMCP)各10.00 g，分别加入去离子水50 mL，混合均匀后置于50 ℃水浴中超声波提取2 h，过滤，滤渣用同样的方法提取1 h，混合2次滤液并蒸发浓缩，离心(5 000 r/min，5 min)后定容至100 mL，即得到100 mg/mL的样品提取液，放置冰箱备用。按照Liu等[18]方法并略有修改，将不同浓度(10～50 mg/mL)的样品提取物溶液3.0 mL与DPPH· 溶液1.0 mL(95%乙醇中配置，浓度为10-4moL/L)混匀后，于波长517 nm处测定吸光度(Ai)，同时，将DPPH·溶液1.0 mL 与样品空白3.0 mL混匀后测定吸光度(Ac)，将不同浓度的样品提取物溶液3.0 mL与95%乙醇溶液1.0 mL混匀后测定吸光度(Aj)，按式(1)计算DPPH·清除率：

(1)

式中：

s——DPPH·清除率，%；

Ai——样品液组吸光度；

Aj——DPPH·空白组吸光度；

Ac——样品空白组吸光度。

1.2.6 数据统计分析 采用SPSS 15数据处理软件，各组数据结果均以平均值±SD(n=3)表示，并进行方差分析，最小显著性差异检验(LSD)进行多重比较，P<0.05为差异显著性。

2 结果与分析

2.1 超微粉碎和普通粉碎对山银花的颗粒结构和微观形态的影响

山银花超微粉和细粉的FT-IR图谱如图1所示，二者非常相似，表明超微粉碎对山银花中各组分主要官能团及活性成分的结构影响较小；但与山银花细粉相比，超微粉在3 407，2 919，2 360，1 629，1 047 cm-1等处的吸收峰均增强，说明粗多糖及纤维类特征吸收峰增强，可能是纤维素、半纤维素、木质素等大分子受到剧烈机械力作用，发生分子链断裂现象，分子聚合度有减小趋势，更多葡萄糖苷键、氢键等基团暴露；也可能是超微粉碎后粉体粒径减小，相同条件下颗粒数目相对增多，暴露出更多的亲水基团，使其吸收峰增强[19]。

A. 细粉 B. 超微粉

山银花超微粉和细粉的扫描电镜(SEM)如图2所示。山银花细粉形状各异，粒径较大，表面较粗糙。经过超微粉碎后，山银花原片状结构被切断，呈现粒径较小、形状多为圆锥形或束形、纤维单个散在或数个成束的微粒结构特性。由图3可知，经过普通粉碎的山银花颗粒分布范围较广，平均粒径为3 368 nm(分散系数PDI为0.817)，经过超微粉碎的山银花颗粒平均粒径为535.5 nm(分散系数PDI为0.540)。可见，经过超微粉碎后，其粒径分布区域变窄。研究发现，超微粉碎通过剪切力改变了物料大小，未有效改变纤维的结晶结构，只是改变纤维的颗粒大小[20]。经超微粉碎后，粒径减小，同时粉碎过程中纤维等大分子长链发生断裂，使得羧基、羟基等基团充分暴露出来，从而改善其物化特性。

2.2 超微粉碎和普通粉碎对山银花的有效活性成分含量的影响

山银花超微粉和细粉的绿原酸、总皂苷(灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙)、木犀草苷、咖啡酸等有效活性成分含量见图4；其中山银花超微粉的绿原酸、总皂苷和咖啡酸含量显著高于细粉(P<0.05)的；木犀草苷含量无显著性差异。结果显示，超微粉碎处理促进山银花活性成分溶出。化学成分是药效物质基础，研究如何提高活性成分含量能够更好地指导山银花的综合利用和成分提取[5-6]。Xiao等[21]研究发现超微粉碎可以提高茶叶粉中水溶性成分茶多酚、咖啡碱、多糖的含量，并认为是由于超微粉的粒径减小，导致细胞壁破损率增加而提高了水溶性成分的溶出。

图2 山银花粉的扫描电镜(SEM)

图3 普通粗碎与超微粉碎对山银花粉末粒径的影响

*. 超微粉与细粉的活性成分之间差异显著(P<0.05)

Figure 4 Effect of ultrafine and common grinding on the contents of effective compositions ofL.macranthoides

2.3 超微粉碎和普通粉碎对山银花中绿原酸溶出度的影响

以蒸馏水为溶出介质，累计溶出量与测定的绿原酸含量之比即为累计溶出率。山银花超微粉和细粉溶出数据见图5，结果表明超微粉中绿原酸的溶出度和溶出速率与细粉相比均具有较明显的优势，原因主要归结于超微粉具有良好的粒径、比表面积和颗粒孔隙分布，超微颗粒的微观结构变化影响了提取过程中植物化学物质的扩散过程，导致水提取物中可提取的小分子活性成分含量增加，从而提高了溶出量[22]。

2.4 超微粉碎和普通粉碎对山银花抗氧化活性的影响

山银花超微粉和细粉清除DPPH·能力对比如图6所示。LMCP和LMUFP清除DPPH·能力都随着质量浓度的增加而明显增强，均呈剂量效应关系；LMUFP对DPPH·的清除作用要好于LMCP，尤其是在浓度增大时；超微粉清除DPPH·的能力是细粉的1.36倍(浓度均为60 mg/mL时)，说明山银花超微粉抗氧化作用显著高于细粉，与有效成分含量结果一致；原因可能是：① 超微粉碎破坏了原微粒的网状致密结构，暴露出更多的亲水基团，导致亲水性增加，其清除DPPH·能力随之提高[22]，这与FT-IR和SEM表征分析结果一致，均证实了超微粉碎对山银花微粒结构的破坏作用[23]；② 超微粉碎破坏了山银花的细胞壁及其内部网状结构，造成更多的可溶性小分子活性成分溶出[24]，这与“2.2和2.3部分”的活性成分含量及其溶出数据一致。此外，传统山银花提取物或浸膏均采用高温处理，而超微粉碎全过程均处于低温状态，有效防止了热敏性成分及多酚的氧化和降解，具有更广泛的应用前景。

图5 山银花超微粉和普通细粉中绿原酸的溶出曲线

Figure 5 The dissolution curve of chlorogenic acid of ultrafine and common grinding ofL.macranthoides

图6 超微粉碎和普通粉碎对山银花清除DPPH·能力的影响

Figure 6 Effect of ultrafine and common grinding on the DPPH· scavenging activity ofL.macranthoides

3 结论

超微粉碎使山银花药材的微粒结构(细胞壁及粗纤维结构)改变，提高了绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、木犀草苷、咖啡酸等活性成分的溶出量及溶出速率，所以提高了其清除DPPH·的能力。通过山银花粉末微粒结构结合活性成分及抗氧化能力评价，揭示了超微粉碎对山银花全粉的影响，对山银花的综合利用和产品开发具有指导意义。目前山银花的研究仍侧重于化学成分与药理作用的研究，将来研究的重点是开展山银花系统研究，针对基原、不同产地、不同加工方法和产品研发及其综合利用进行研究。因此，山银花直接超微粉碎作为一种营养补充剂，替代山银花提取物或者浸膏，在活性成分富集、抗氧化能力增强等方面具有较好的应用前景。