低聚异麦芽糖和棉籽糖对乳酸杆菌增殖及产酸效果的研究

■ 吕宏伟 毕梦凡 谷雪玲 肖克权 宋泽和 贺 喜 范志勇*

（1.湖南省畜禽安全生产协同创新中心，湖南长沙410128；2.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128）

肠道微生态是肠道内微生物与宿主形成的一个微生物系统，以乳酸杆菌为主的有益菌和以大肠杆菌、沙门氏菌为主的有害菌构成的微生态平衡是维持动物体健康的重要因素。为了提高畜禽的生产性能，改善肠道健康，提高肠道内有益菌的数量变得尤为重要。IMO和RFO作为益生元能够明显促进乳酸杆菌等有益菌的增殖，且不被有害菌沙门氏菌或大肠杆菌所利用[1]，从而达到改善动物肠道功能的作用。这在武书庚等[2]和刘佰阳等[3]的研究中都被证实，而目前的研究中鲜有报道IMO与RFO之间的作用效果的比较，特别是对乳酸杆菌增殖和产酸效果的比较。因此，本试验通过比较IMO和RFO对于乳酸杆菌增殖和产酸效果的能力，阐明IMO与RFO之间的作用效果,为低聚糖在畜禽生产上的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

乳酸杆菌：德氏乳酸杆菌微胶囊粉制剂（活菌数≥1.01×109CFU/ml）由北京国家粮食局科学研究院生产包被，该菌种由湖南农业大学功能微生物实验室筛选，武汉大学菌种保藏中心鉴定保藏（保藏号M207096）。

1.1.2 糖类

IMO和RFO由绿叶生物科技有限公司提供，500 g/瓶，纯度98%。

1.1.3 培养基

MRS肉汤：用于乳酸杆菌的菌种活化，其配方（绿叶生物科技有限公司）如下：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾（无水）2.0 g，柠檬酸三铵（无水）2.0 g，硫酸镁0.2 g，四水硫酸锰 0.05 g，乙酸钠5.0 g，吐温-80 1.0 ml，蒸馏水1 000 ml，pH值(5.7±0.2)。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

MRS液体培养基：用于IMO和RFO对乳酸杆菌的体外增殖试验。其配方（绿叶生物科技有限公司）如下：胰蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，酵母浸粉4.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，四水硫酸锰0.05 g，乙酸钠5.0 g，吐温-80 1.0 ml，蒸馏水1 000 ml，pH值(6.2±0.2)，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.4 仪器

超净台（苏州江东精密仪器有限公司SW-CJ-2FD）、恒温生化培养箱（ADX-SHP）、高压蒸汽灭菌锅（立式压力蒸汽灭菌锅 LDZX-50KBS）、烘箱（JINGHONG公司XMTD-8222）、移液枪（LICHENG公司WKYIII-200）、PH计（德国德图 testo 205）、酶标仪（Thermo公司 MULTISKAN GO）。

1.2 试验设计

本试验采用单因素试验设计，分为对照（CON组，不含葡萄糖的MRS液体培养基）、IMO组（MRS中添加2.0%IMO）和RFO组（MRS中添加2.0%RFO），每组三个重复。分别于接种乳酸杆菌后0、8、16、24、32 h和40 h测定各处理培养基的OD值和pH值，并建立各组乳酸杆菌的生长曲线图和发酵液pH值曲线图。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 菌种活化

将乳酸杆菌菌粉接种在MRS肉汤培养基中，37 ℃、140 r/min摇床培养12～24 h，即为活化的乳酸杆菌菌液。

1.3.2 乳酸杆菌发酵液吸光度的测定

分别于接种后0、8、16、24、32 h和40 h用酶标仪测定发酵液的OD420值。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，吸光度(OD值)可表示样品菌液浓度[4]。

1.3.3 乳酸杆菌发酵液pH值的测定

于接种后0、8、16、24、32 h和 40 h用pH计测定发酵液的pH值。

1.3.4 数据处理

数据用Excel完成处理，采用SPSS 20.0软件进行one-way ANOVA统计分析，若组间差异显著，则采用Duncan's法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著。试验结果以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 低聚异麦芽糖和棉籽低聚糖对乳酸杆菌增殖的影响（见图1）

由图1可知，与对照组相比，低聚异麦芽糖和棉籽低聚糖均能显著提高乳酸杆菌培养基OD值（P＜0.05）。发酵24 h之前，IMO组的乳酸杆菌数量显著高于棉籽低聚糖组，但在24 h之后，RFO组中乳酸杆菌数显著高于IMO组。

图1 IMO和棉籽低聚糖对乳酸杆菌生长作用曲线

2.2 低聚异麦芽糖和棉籽低聚糖对乳酸杆菌发酵液pH值的影响(见图2)

由图2可知，与对照组相比，低聚异麦芽糖和棉籽低聚糖均能明显降低乳酸杆菌发酵液pH值（P＜0.05）。发酵24 h之前，IMO组的乳酸杆菌发酵液pH值明显低于RFO组（P＜0.05）；在发酵24 h之后，RFO组的发酵液pH值明显低于IMO组（P＜0.05）。

3 结论与讨论

乳酸杆菌作为益生菌在动物肠道中发挥着重要的作用。乳酸杆菌可以产生乳酸、过氧化氢和细菌素等抗菌物质[5-6]，增强上皮细胞的屏障功能和免疫功能[7-9]。IMO作为一种益生元，能够有效地促进乳酸杆菌的增殖，具有调节消化道微生物区系的作用[10]。本试验结果表明，离体培养条件下，IMO对乳酸杆菌呈现出明显的增殖效果，其作用程度优于葡萄糖基础培养基，这与李晓卉[11]和房晓等[12]的研究相似。研究表明，益生菌对低聚糖的利用情况不仅与益生元种类有关，也存在时间差异。万荣峰等[13]在不含葡萄糖的肉汤培养基中添加低聚糖，乳酸杆菌在前24 h处于增值阶段，而24～48 h乳酸菌数量呈现下降趋势。在本试验中IMO和RFO对乳酸杆菌的增殖与时间密切相关，在16 h前IMO组乳酸杆菌增值效果显著升高，而在16 h之后无显著变化，RFO组在24 h前乳酸杆菌增殖效果显著升高，而在24 h之后无显著变化，说明RFO的作用效果具有延后效应。

图2 低聚异麦芽糖和棉籽低聚糖对乳酸杆菌发酵液pH值的影响曲线

IMO和RFO均能显著降低培养基的pH值，但其作用效果因低聚糖的种类而异。IMO组在0～24 h内pH值显著高于RFO组，而在24 h之后相反，说明乳酸杆菌对低聚糖的利用具有选择性，24 h可能是不同种类低聚糖对肠道菌群影响的分界点，这与刘露等[14]的研究相似。本试验表明，低聚糖对乳酸杆菌的pH值作用效果不仅与低聚糖种类有关，还存在时间差异。在16 h前IMO组pH值显著降低，而在16 h后无显著变化，RFO组在24 h前pH值显著降低，而在24 h之后无显著变化。产生这种作用效果的原因可能与糖分子的结构差异有关，不同低聚糖分子内的糖苷键对益生菌的生长会产生不同的效果。本试验也证实了两种低聚糖对乳酸杆菌生长的影响也存在差异。

低聚糖在单胃动物的胃内不能被消化酶分解，在小肠中几乎不能被利用，主要在后肠中被肠道菌群选择性发酵，大多数有益菌能利用低聚糖，但是对低聚糖呈现出偏好性，所以乳酸菌对IMO和RFO的利用情况是不同的，这呈现出了菌株的特异性。总体来说，乳酸菌的生长速度和产酸速率呈正相关，但这一现象并不绝对，例如生长速率接近的两株干酪乳酸菌，产酸速率相差较大，说明即使是同一种菌，对同种低聚糖的利用特性也可能不同。刘思思[15]研究表明，菌株的定殖性能与菌株利用低聚糖的能力可能有关，但并不与低聚糖利用能力呈正相关，只有长期使用低聚糖，菌株的定殖性能才会延长。低聚糖对乳酸菌增殖的作用机理在于低聚糖不只充当一种碳源或营养物质，还可能参与了乳酸菌的生长调节。细菌利用低聚糖通常需要转运蛋白和糖苷酶的参与[16],目前已在乳酸菌中分离出纯化的β-葡萄糖苷酶、谷氨酸脱羧酶、脱氧胞苷激酶等，不同的酶活性不同，乳酸杆菌对IMO和RFO的利用率可能和这些酶与IMO和RFO的反应速率有关，后续可以从乳酸菌的代谢途径或降解低聚糖的酶系统甚至是基因层面进行差异探究。

本试验结果表明，IMO和RFO均能显著促进乳酸杆菌的增殖，其作用效果与低聚糖的种类和时间有关。因此，生产中可根据目的合理的选择低聚糖，也可根据不同低聚糖的作用进行组合使用。