添加植物乳杆菌对桑枝叶与玉米秸秆混合青贮发酵品质的影响

2019-01-03唐庆凤杨承剑彭开屏郭艳霞李丽莉辛李孟伟唐振华

饲料工业 2018年19期

■唐庆凤杨承剑彭开屏郭艳霞李丽莉梁辛李孟伟唐振华

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁530001）

随着畜牧业迅速增长，常规饲料资源不断紧缺，寻找新的饲料资源已迫在眉睫。广西是我国主要的蚕桑基地，据统计，2016年广西桑园面积达20.53万公顷[1]，桑枝叶具有蛋白质含量高、氨基酸含量丰富、消化率高、产能高等特点，作为畜禽饲料具有较大的开发潜力和重要的利用价值[2-3]。但桑树冬季无法提供桑叶，而反刍动物主要是在冬季缺乏青绿饲料的供给，如能将鲜桑枝叶进行青贮处理，不仅可以大大延长桑枝叶饲料利用时间，使其适口性增强，可消化营养含量提高，还可以填补草食畜牧业饲草冬季生长淡季草料来源受限的缺陷，促进草食畜牧业的发展。

优质青贮饲料调制不仅需要严格的厌氧条件，原料中还应有充足的乳酸菌数量和活性及足够的水溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC），研究表明，乳酸菌数量达到青贮原料鲜重的105CFU/g以上，新鲜原料中WSC含量为25～35 g/kg，是成功青贮的最低限度[4]。董志浩等[5]研究显示：桑叶原料表面附着的乳酸菌数量为106.73CFU/g FW，与玉米和紫花苜蓿附着的乳酸菌数量相当，但桑叶直接青贮前7 d未见大量乳酸生成，而添加乳酸菌青贮组第7 d乳酸含量已达到桑叶直接青贮组的6倍以上，pH值降至4.27以下，表明添加乳酸菌明显改善了桑叶青贮发酵品质，可能是因为桑叶本身附着的乳酸菌数量虽然较多，但是活性不强，且产乳酸能力较弱。Hristov等[6]在全株玉米青贮中添加不同类型的乳酸菌制剂明显降低了pH值、丁酸和氨态氮的含量，提高了总酸和乳酸的含量。赵庆杰等[7]研究表明，在青稞秸秆和多年生黑麦草混合青贮中添加乳酸菌，加速了青贮早期乳酸的发酵进程。吴配全等[8]在肉牛日粮中分别添加青贮桑叶10%和20%，可使肉牛增重的饲养成本下降0.29～0.49元/kg，而且添加20%桑叶有增加肉牛血液中高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的趋势。朱万福等[9]开展了桑枝叶混合青贮育肥滩羊公羔效果研究，结果表明：试验组比对照组日增重提高4.06%（P＞0.05），料肉比降低1.03%（P＞0.05），研究还表明，调制桑枝叶青贮和全株玉米青贮混合比单一性桑枝叶青贮或者全株玉米青贮饲养效果较好。目前国内外的研究大多集中在乳酸菌对桑叶发酵效果的影响，桑叶及桑枝叶青贮饲料饲喂效果等方面，但添加乳酸菌对桑枝叶及玉米秸秆混合青贮发酵品质的影响未见报道。因桑叶本身附着的乳酸菌活性不强，产乳酸能力较弱，且桑枝叶的WSC含量偏低，因此桑枝叶直接青贮较难获得优质青贮饲料。本试验在桑枝叶与玉米秸秆混合（鲜质量比为1∶1）青贮的基础上，通过添加植物乳杆菌制剂以期进一步改善混合青贮发酵品质，为桑枝叶饲料的开发及利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料：新鲜玉米秸秆（蜡熟期）由广西水牛研究所水牛种畜场提供，新鲜桑枝叶由桂平市桑树种植基地提供。混贮原料的营养水平见表1。

表1 原料的营养水平（风干基础）

添加剂：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LAP），购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

培养基：MRS的液体培养基用于LAP活化和菌液培养，MRS固体培养基用于LAP涂板计数。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化及扩培

LAP安瓿管冻干菌种→活化→按5%添加量接种到MRS的液体培养基中，培养温度为37℃，静态厌氧培养。接种液计数：采用涂板对LAP接种液进行计数。

1.2.2 试验设计

将桑枝叶与玉米秸秆以1∶1的鲜重比例进行混合，本试验在青贮原料中分别加入不同水平的乳酸菌添加剂，设置5个处理，每个处理3个重复，各处理LAP菌液添加量分别为青贮原料鲜重的0%、2%、4%、6%和8%。

1.2.3 青贮调制

试验在广西水牛研究所研发中心进行，将桑枝叶与玉米秸秆进行人工切断，长度为2 cm左右，按1∶1比例进行称样，装入聚乙烯薄膜袋中，每袋混合青贮原料400 g，各处理乳酸菌添加量按照设计比例进行，混合均匀，用真空泵抽出袋内的空气至真空状态，密封，避光置于室温下贮藏60 d，开袋进行发酵品质和营养成分分析。各组植物乳杆菌（LAP）菌落单位见表2。

表2 各组植物乳杆菌菌落单位(CFU/g)

1.3 测定项目及方法

1.3.1 常规项目

采用常规的测定方法[10]测定样品中的DM、CF、CP含量。

1.3.2 青贮饲料感官评定

感官评定参考我国农业部1996年发布的《青贮饲料质量评定标准（试行）》进行，通过色泽、气味、质地及霉变等情况进行评定，感观评定标准见表3，再以乙酸和丁酸的含量来评价发酵饲料的等级[11]。

表3 发酵感官评定标准

1.3.3 青贮饲料品质项目分析

1.3.3.1 样品预处理

开袋后，每袋准确称35 g样品，放入250 ml的广口瓶中，再加入150 ml超纯水，使样品完全浸入在水中，用封口胶将广口瓶盖密封，放入4℃冰箱提取24 h，取出后使用2层纱布进行过滤，滤液用于挥发性脂肪酸、乳酸、pH值的测定。剩余的青贮饲料样品在65℃下烘干、粉碎（过40目筛）制成风干样，用于常规营养成分及WSC的测定。

1.3.3.2 挥发性脂肪酸的测定

取1.3.3.1节所获得的滤液0.5 ml，加入8.2%偏磷酸0.5 ml，于13 000 r/min离心10 min，然后取上清液加入巴豆酸后，用Agilent-7890A型气相色谱仪[12]进行测定，测定样品中乙酸、丙酸、丁酸的含量。

1.3.3.3 乳酸测定

青贮饲料中乳酸含量用试剂盒进行测定，试剂盒的货号为A019-2，厂家为南京建成生物工程研究所。

1.3.3.4 pH值测定

pH值采用便捷式pH计进行测定，pH计型号：HANNA HI-8424。

1.3.3.5 干物质回收率（dry matter recovery，DMR）的测定

DMR（%）=(开封时样品质量×样品干物质率)/（装袋时装入样品的质量×样品原料干物质率）×100[12]。

1.3.3.6 可溶性碳水化合物测定

采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物含量[13]。可溶性糖在浓硫酸溶液中先脱水为糖醛或羟基糖醛，再与蒽酮发生反应生成蓝绿色化合物，其颜色与含糖量成正比，吸收峰波长为640 nm。

1.4 数据统计分析

试验数据先使用EXCEL软件进行处理，再使用SPSS 17.0软件进行单因子方差分析和Duncan's多重比较检验，试验结果的差异显著性以P＜0.05作为判断标准，试验数据均采用“平均值±标准差”的方法来表示。

2 结果

2.1 营养成分分析（见表4）

由表4可知，各试验组的DM含量均低于对照组，其中，LAP 8%组DM含量最低，与对照组相比降低了7.14%（P＜0.05）。DMR含量各组间差异不显著（P＞0.05），但各试验组的DMR含量均高于对照组。CP和CF含量各组间差异不显著（P＞0.05），其中，LAP 6%组的CP含量最高，CF含量最低。各试验组的WSC含量均高于对照组，LAP 4%组WSC含量最高，与对照组相比升高了51.82%（P＜0.05）。

表4 植物乳杆菌对混贮料营养成分的影响

2.2 发酵品质分析（见表5）

由表5可知，随着植物乳杆菌制剂添加量的增加pH值不断下降，LAP 6%组和LAP 8%组的pH值均显著低于对照组（P＜0.05），与对照组相比，分别降低了1.66%（P＜0.05）和4.98%（P＜0.05）。各试验组乳酸含量均显著高于对照组（P＜0.05），其中，LAP 6%组的乳酸含量最高，与对照组相比，升高了56.48%（P＜0.05）。乙酸含量各组间差异不显著（P＞0.05），其中LAP 6%组含量最高为55.13 mmol/kg。丙酸含量LAP 8%组最高，且显著高于其他各组（P＜0.05）。丁酸含量各组间差异不显著（P＞0.05），各试验组丁酸含量均低于对照组，且LAP 6%组丁酸含量最低。

表5 植物乳杆菌对混贮料发酵品质的影响

2.3 发酵品质的评定（见表6、表7）

由表6可知，发酵60 d后，LAP 2%组感官质量稍差，开袋时芳香味较弱，有淡酸味，质量评分为42分，青贮效果评定为良好。其他各组开袋时均有甘酸香味，呈亮黄色，结构良好，青贮质量评定为优等,且LAP 6%组评分最高为48分。以乙酸和丁酸含量评定发酵品质的结果见表7，由表7可知，各组发酵品质均达到1级水平。

表6 混贮料发酵品质的感官评定

表7 以乙酸和丁酸含量评价混贮料发酵品质

3 讨论

3.1 添加植物乳杆菌对桑枝叶与玉米秸秆混贮料营养成分的影响

乳酸菌制剂是目前应用于青贮饲料生产中最为常用的青贮添加剂，它的主要作用是调节青贮饲料内微生物区系，调控青贮发酵过程，更有效地保存饲料的营养物质[14]。张淑枝等[15]研究乳酸菌制剂对全株玉米青贮发酵品质及消化率的影响，结果表明，在全株玉米中添加10 g/t（青贮鲜重）的乳酸菌制剂，青贮80 d，与对照组相比，乳酸菌制剂处理组显著地提高了青贮料的干物质回收率（P＜0.05），提高幅度为15.39%。荣辉等[16]为评价添加乳酸菌制剂、绿汁发酵液和葡萄糖对象草青贮发酵品质的影响，结果显示与对照组相比，无论是葡萄糖单独添加组还是与乳酸菌制剂组合添加组均提高了整个青贮过程中的WSC含量。本试验在桑枝叶与玉米秸秆混贮中添加不同剂量的植物乳杆菌制剂，一定程度上减少了营养物质的损失，经过60 d的青贮，结果也显示各试验组的DMR和WSC含量均高于对照组，且LAP 4%组的WSC含量显著高于对照组（P＜0.05），可能是由于添加了植物乳杆菌制剂使乳酸菌在发酵前期迅速占领了主导地位，LAP以青贮原料中的糖为底物通过糖酵解途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸，使青贮饲料pH值降低，从而抑制其他有害微生物的活性，抑制了青贮过程中微生物和植物蛋白酶对氨基酸和蛋白质的降解作用，从而减少了营养物质的损失[17]，而试验中LAP 6%组的WSC含量在各试验组中最低，可能是由于添加的LAP数量及青贮原料含水量较合适，使LAP能够充分发挥活性，将青贮原料中较多的糖转化为乳酸。添加植物乳杆菌制剂后，各试验组的CF含量均低于对照组，但差异不显著，与Meeske等[18]的研究结果一致，可能是由于青贮料在发酵过程中纤维被软化，且在酶类和微生物的作用下部分纤维被降解[19]。各组CP含量差异不显著，但含量均达到15.5%左右，可满足青年牛及干奶牛对日粮蛋白质的要求。广西山多地少，缺乏优质牧草，而桑枝叶产量大，营养全面丰富，桑枝叶与玉米秸秆混贮，可使桑枝叶饲料适口性增强，可消化营养含量提高，发酵后产生大量的益生菌，还能够调节家畜的胃肠道的菌群环境，提高家畜的免疫机能和抗病能力，有利于促进桑枝叶高效处理及饲料化，为反刍动物提供更加丰富的饲料资源，促进草食畜牧业的发展，同时还可以在一定程度上提高桑农的经济效益。

3.2 添加植物乳杆菌对桑枝叶与玉米秸秆混贮料pH值及有机酸含量的影响

青贮原料附着的乳酸菌种类和数量是影响青贮饲料发酵品质的重要因素之一，因此青贮时添加乳酸菌，尤其是同型发酵乳酸菌如植物乳杆菌等，可以促进青贮早期乳酸的产生，迅速降低青贮饲料的pH值，从而抑制霉菌和丁酸梭菌等有害微生物的活性，降低氨态氮及丁酸含量，提高青贮饲料发酵品质[20]。本试验中，随着植物乳杆菌制剂添加量的增加，pH值不断下降，对照组pH值为4.22未达到优质青贮的要求，但LAP 6%组和LAP 8%组的pH值分别为4.15和4.01均达到了优质青贮的要求，且各试验组乳酸含量均显著高于对照组（P＜0.05），这可能是由于原料本身附着的乳酸菌活性不强，产乳酸能力较弱，添加植物乳杆菌制剂增加了桑枝叶与玉米秸秆混贮料青贮初期同型乳酸菌的数量，提高了乳酸的产生速率，导致乳酸含量升高，pH值降低，有利于抑制有害微生物的活性，提高青贮发酵品质，这与刘辉等[21]和董志浩等[5]的研究结果一致。

有机酸含量是评价青贮发酵品质优劣的重要指标，其中最重要的是乳酸、丁酸和乙酸含量，优质青贮饲料应具有较高含量的乳酸和较低含量的丁酸[22]。一般认为优质的青贮饲料丁酸含量应该低于1%DM[23]。丁酸是有害微生物分解蛋白质、糖类和乳酸的产物，易导致青贮饲料营养物质的损失，且蛋白质分解会产生使青贮饲料具有恶臭的氨或胺，影响青贮品质。本试验中各组丁酸含量均低于优质青贮的丁酸含量推荐值（小于1%DM），但各试验组丁酸含量均低于对照组，且LAP 6%组丁酸含量最低，说明在桑枝叶与玉米秸秆混贮料中添加植物乳杆菌制剂，能在一定程度上抑制丁酸梭菌的活性，降低丁酸的含量，且LAP 6%组添加效果最好。王应芬等[24]研究酶和乳酸菌对多年生黑麦草与玉米秸秆混合青贮发酵品质的影响，结果也表明添加乳酸菌制剂或酶制剂均提高了玉米秸秆与多年生黑麦草混合青贮饲料的发酵品质，添加剂组丁酸含量、pH值均显著低于对照组（P＜0.05），而乳酸和水溶性碳水化合物含量增加。乙酸具有较强的抗真菌能力，能够有效地抑制青贮料有氧暴露阶段霉菌、酵母菌的生长繁殖[25]。本试验中乙酸含量各组间差异不显著（P＞0.05），可能是因为试验中添加的乳酸菌制剂为植物乳杆菌，植物乳杆菌属于同型乳酸菌，同型乳酸菌将一分子六碳糖转化为两分子乳酸，没有乙酸产生。

3.3 青贮发酵品质评价

王昆昆等[26]研究不同乳酸菌制剂添加量对不同比例披碱草和苜蓿混贮发酵品质的影响，发酵45 d后采用V-score评定体系进行发酵品质评定，结果显示在40∶60、50∶50和30∶70混贮比例中，未添加乳酸菌制剂的对照组得分最低，等级评定为尚可，其中以30∶70混贮料乳酸菌制剂添加量为0.025%时青贮料得分最高。还表明乳酸菌制剂对披碱草和苜蓿混贮的发酵品质有显著影响(P＜0.05)。感官评定主要通过观察青贮料气味、色泽和质地等来粗略评判发酵品质[27]，而Kaiser评价体系主要评价不良发酵，丁酸的产生会伴随较高的pH值及蛋白质的大量降解，乙酸含量反映青贮料的保存性能和有氧稳定性，该评定体系适合所有牧草青贮发酵品质的评定[11]。本试验先参照我国农业部1996年发布的《青贮饲料质量评定标准（试行）》来对青贮品质进行感官评定，然后再以乙酸和丁酸的含量来评价发酵饲料等级，综合两个评价体系的结果为：桑枝叶与玉米秸秆以1∶1鲜质量比混贮，虽然不添加任何添加剂也可青贮成功，但添加植物乳杆菌制剂后青贮效果更好，有利于提高该混贮发酵品质，其中LAP 6%组发酵品质最佳。